ECTS - University of Pisa
Lo studente avrà acquisito conoscenze sulla realtà del laboratorio dal punto di vista organizzativo e soprattutto in merito all' operatività.
Verranno approfonditi i principi che stanno alla base dei test di laboratorio impiegati in biochimica clinica.
Biologia molecolare: lo studente avrà acquisito le conoscenze di base sulla struttura, funzione e manipolazione degli acidi nucleici
Esame scritto
Oral examination
lo studente sarà in grado di comprendere i principi che stanno alla base dei test eseguiti in laboratorio ed individuare eventuali azioni correttive per risoluzione delle problematiche.
Tirocinio in laboratorio
Lo studente potrà acquisire conoscenze sulle principi che stanno alla base dei test esguiti in laboratoriorio di biochimica clinica e biologia molecolare. Inoltre, potrà sviluppare consapevolezza per risoluzione di problematiche inerenti il corretto svolgimento del proprio lavoro ed attendibilità dei risultati prodotti
La verifica dei comportamenti avverrà in aula con attraverso un confronto diretto tra docente e studenti.
Tale verifica sarà occasione per chiarire eventuali dubbi e risolvere criticità.
Per seguire il corso non è necessaria alcuna conoscenza iniziale.
Per seguire il corso non è necessario seguire alcun insegnamento parallelo
La frequenza del corso non costituisce un requisito obbligatorio per la frequenza di corsi successivi.
Sono previste lezioni frontali ed esercitazioni in aula o laboratorio
METODOLOGIE ANALITICHE
BIOLOGIA MOLECOLARE
Cenni storici. Gli acidi nucleici, struttura e funzioni. Organizzazione del genoma eucariotico, procariotico e mitocondriale. La replicazione del DNA. Paradosso C, K, N. Sistemi di riparazione del DNA. Tipi di RNA e loro funzioni. La trascrizione. Operone Lac e operone Trp. Regolazione della trascrizione nei procarioti: controllo epigenetico e fattori di trascizione. Cos’è l’imprinting. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) e superschift. Maturazione dell’mRNA (capping, poliadenilazione , splicing ed editing) e dell’rRNA. Il codice genetico. La traduzione. I miRNA, DROSHA, DICER, RISCH. Metodi di estrazione degli acidi nucleici (fenolo /cloroformio, Tryzol, salting out, kit commerciali con biglie magnetiche e colonnine). La precipitazione del DNA. western blotting cenni Qualità e quantificazione degli acidi nucleici: metodo spettrofotometrico e controllo elettroforetico. Elettroforesi degli acidi nucleici su gel di agarosio e su gel di poliacrilammide. Pulsed-field gel electroforesys (PFGE). L’ibridazione: curva di denaturazione del DNA, temperatura di melting. Tipi di sonde e fattori che influenzano l’iridazione. Il Southern blotting. Il Nothern blotting. La PCR. Touchdown PCR. Nested primer PCR. Come disegnare i primer. Tipi di contaminazioni possibili e organizzazione ottimale di un laboratorio di biologia molecolare. Reverese Trasciptase PCR. Real Time PCR. SYBR green, sonde specifiche (sonde Taq man, sonde FRET, molecular beacon). Analisi del segnale: curve di amplificazione e curve di melting. Quantificazione relativa e assoluta. Cenni sul modulo HRM. Enzimi di restrizione. La transfezione stabile e transiente. Metodi per transfettare. Tipi di vettori per il clonaggio: plasmidi, cosmidi, fagi, cromosoma batterico e di lievito. Il clonaggio del cDNA tramite enzimi di restrizione e topo cloning vector. Fase di screening mediante inattivazione inserzionale con doppio antibiotico e mediante inattivazione della beta-galattosidasi (colonie bianche/blu). Subclonaggio in vettori di espressione. Il sequenzaimento del DNA: il metodo di Sanger. I polimorfismi. Ibridazione in situ. PCR e RT-PCR in situ. Microarray. Editing genomico: CRISPR/Cas9.
BIOCHIMICA CLINICA
Aspetti generali di biochimica clinica. Preparazione del campione biologico. Principali alterazioni del campione biologico e approccio sistematico alla gestione del campione biologico. Bioregolatori: elettroliti e molecole volatili. Alterazione del bilancio idroelettrolitico, significato clinico e metodi di determinazione. Equilibrio acido base nel sangue, disordini acido-base e metodi di determinazione (emogasanalisi). Esame emocromocitometrico: caratteristiche principali e approccio clinico. Anemie, coagulazione e approccio alle principali alterazioni. Vitamine e valutazione delle principali alterazioni. Metabolismo dei Carboidrati. Studio di ipo- ed iperglicemie. Metodi di misurazione della glicemia. Lipoproteine e lipidi. Studio delle dislipidemie e disturbi aterosclerotici. Valutazione biochimica-funzionale del fegato (bilirubina totale diretta e indiretta, AST, GOT, LDH, ALP, γGT).Valutazione biochimico-funzionale del rene (GRF, PRF, FG, FF, creatinina, acido urico, urea). Analisi delle urine. Aspetti generali dell'endocrinologia: ruolo dell'ipotalamo, Ipofisi, Tiroide, Paratiroide, Gonadi, Surrene, Corticosurrene e Pancreas. Marcatori tumorali: ruolo e utilizzo nella pratica clinica
ANALYTICAL METHODOLOGIES
1. Hints of laboratory organization. Preanalytics and inherent issues. Urgent and routine examinations. Decentralized analyses. Practical examples and critical issues. Quality control: Internal and external quality control. Types of errors. Accuracy and precision. Specificity and sensitivity.
2. Repeatability and reproducibility. Interlaboratory and intralaboratory controls. Fiduciary limits. Control charts: Levey and Jennings, cumulative sum chart. How to set up quality control with serum pools; practical example. Westgard rules. Corrective actions when paper is out of control. Centrifugation techniques (principles of sedimentation). Types of centrifuges and rotors. Differential centrifugation. Density gradient, isopycnic and zonal centrifugation. Ultracentrifugation.
3. Chromatographic techniques: General principles. Selectivity and efficiency. Theoretical plate number. Column, thin-layer, paper chromatography. Adsorption chromatography. Breakdown chromatography. Ion exchange chromatography. Exclusion chromatography. Affinity chromatography. Gas chromatography. HPLC. Hints on glycated hemoglobin and detailed description of the HPLC 723G8 instrument. Interpretation of chromatographic peaks.
4. Immunochemical techniques: Antigens and Antibodies. Antigen-antibody binding. Immunoprecipitation techniques-simple radial immunodiffusion and double immunodiffusion. Competitive Elisa, Elisa double antibody method. RIA - liquid phase and solid phase separation methods. IRMA Hints of radiation protection. Immunofluorescence, direct and indirect.
5. Practical example of how to perform an ELISA test; significance of standard curve; how to interpret absorbance values, trace back to possible concentrations of analytes sought. Electrophoresis, basic principles. Capillary electrophoresis. Interpretation of results. Fundamentals of spectrophotometry. Wavelength and frequency. Monochromatic and polychromatic light. Quantitative and qualitative analysis. Emission and absorption spectra. Transmittance, absorbance and Lambert and Beer's law. Basic principles. Generalities about spectrophotometers.
6. Hints of optical microscopy.
MOLECULAR BIOLOGY.
Historical background. Nucleic acids, structure and functions. Organization of the eukaryotic, prokaryotic and mitochondrial genome. DNA replication. Paradox C, K, N. DNA repair systems. RNA types and their functions. Transcription. Lac operon and Trp operon. Regulation of transcription in prokaryotes: epigenetic control and transcription factors. What is imprinting. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and supershift. Maturation of mRNA (capping, polyadenylation , splicing and editing) and rRNA. The genetic code. Translation. The miRNAs, DROSHA, DICER, RISCH. Nucleic acid extraction methods (phenol/chloroform, Tryzol, salting out, commercial kits with magnetic beads and columns). DNA precipitation. western blotting hints Quality and quantification of nucleic acids: spectrophotometric method and electrophoretic control. Electrophoresis of nucleic acids on agarose gels and on polyacrylamide gels. Pulsed-field gel electroforesys (PFGE).
Hybridization: DNA denaturation curve, melting temperature. Probe types and factors affecting hybridization. Southern blotting. The Nothern blotting. PCR. Touchdown PCR. Nested primer PCR. How to design primers. Types of possible contaminations and optimal organization of a molecular biology laboratory. Reverese Trasciptase PCR. Real Time PCR. SYBR green, specific probes (Taq man probes, FRET probes, molecular beacons). Signal analysis: amplification and melting curves. Relative and absolute quantification. Hints on the HRM module. Restriction enzymes. Stable and transient transfection. Methods for transfecting. Types of vectors for cloning: plasmids, cosmids, phages, bacterial and yeast chromosome. Cloning of cDNA by restriction enzymes and mouse cloning vector. Screening step by insertional inactivation with double antibiotic and by beta-galactosidase inactivation (white/blue colonies). Subcloning in expression vectors. DNA sequencing: the Sanger method. Polymorphisms. In situ hybridization. PCR and RT-PCR in situ. Microarrays. Genomic editing: CRISPR/Cas9.
CLINICAL BIOCHEMISTRY
General aspects of clinical biochemistry. Preparation of the biological specimen. Major alterations in biological specimen and systematic approach to biological specimen management. Bioregulators: electrolytes and volatile molecules. Alteration of hydroelectrolyte balance, clinical significance and methods of determination. Acid-base balance in blood, acid-base disorders and methods of determination (hemogasanalysis). Hemochromocytometric examination: main features and clinical approach. Anemias, coagulation and approach to major alterations. Vitamins and assessment of main alterations. Carbohydrate metabolism. Study of hypo- and hyperglycemias. Methods of measuring blood glucose. Lipoproteins and lipids. Study of dyslipidemias and atherosclerotic disorders. Biochemical-functional assessment of the liver (direct and indirect total bilirubin, AST, GOT, LDH, ALP, γGT).Biochemical-functional assessment of the kidney (GRF, PRF, FG, FF, creatinine, uric acid, urea). Urinalysis. General aspects of endocrinology: role of the hypothalamus, Hypophysis, Thyroid, Parathyroid, Gonads, Surrene, Corticosurrene, and Pancreas. Tumor markers: role and use in clinical practice
Materiale didattico fornito dai docenti e bibliografia essenziale fornita all'inizio del ciclo di lezioni
Teaching materials provided by lecturers and essential bibliography provided at the beginning of the lecture series
Non sussistono variazioni per studenti non frequentanti in merito a: programma, modalità d'esame, bibliografia, svolgimento di progetti. La frequenza è consigliata.
Esame scritto
Esame scritto
Non sono previste forme di stage, tirocini o collaborazioni con terzi durante lo svolgimento del corso.
Written exam
