ECTS - University of Pisa
| Modules | Area | Type | Hours | Teacher(s) | |
| ANALISI GENETICHE E GENOMICHE | BIO/18 | LEZIONI | 48 |
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Il corso di Analisi Genetiche e Genomiche si pone l'obiettivo di formare laureati con una specifica competenza nelle tematiche e nelle metodologie caratterizzanti la Genetica, la Genomica e la Trascrittomica nelle loro applicazioni per la ricerca di base e applicata.
The student who successfully completed the course will have the ability to highlight the molecular methods of analysis for amplification, genotyping, and sequencing of DNA samples. The student will be able to understand how genetic markers can be used to discover novel genes involved in mendelian traits as well as in complex phenotypes.
La verifica delle conoscenze avviene con esame orale preceduto da 15 minuti dedicati allo svolgimento di esercizi scritti.
In the written exam (2 hours), the student must demonstrate his/her knowledge of the course material and to organise an effective and correctly written reply. The student will be assessed on his/her demonstrated ability to discuss the main course contents using the appropriate terminology.
Methods:
Al termine del corso lo studente sarà in grado di disegnare alcuni test molecolari di analisi del DNA, nonchè di contestualizzare l'utilizzo e l'applicazione di una determinata metodica genomica, genetica e di biologia molecolare, con particolare riferimento al campo della biomedicina, della diagnostica e della farmaceutica.
At the end of the course students will be able to design molecular testing for DNA analysis and be able to interpret the most recent scientific literature regarding the genetics of Mendelian and complex diseases
La verifica delle capacità acquisite avverrà in sede di esame tramite domande aperte o esercizi mirati
Verifying the acquired skills will be in the examination via open or targeted exercises questions
Al termine del corso lo studente avrà le basi necessarie (da approfondire) per progettare uno studio di indagine genetica e molecolare su malattie mendeliane e complesse con particolare riferimento a quelle neoplastiche.
At the end of the course students will have the necessary foundation (to be deepen) to design a study of genetic investigation of any type of disease, Mendelian or not.
I comportamenti acquisiti verranno verificati in sede di esame.
The acqusition of the behaviors will be verified acquired through targeted exercises at the exam.
Le conoscenze della genetica di base, biologia molecolare e alcune nozioni di statistica sono essenziali.
Knowledge of basic genetics (the undergraduate program) are essential. Some statistical concepts, such as the chi-square test, analysis of variance and simple linear regression would be preferable.
Le lezioni sono tutte di tipo frontale.
Delivery: face to face
Learning activities:
Attendance: Advised
Teaching methods:
Presentazione del corso. Libro di testo consigliato. Definizione di genetica. Definizione di Genomica. Il genoma mitocondriale. Approccio generico per studiare sequenze di DNA: ibridazione molecolare e clonaggio del DNA. Tecnica del clonaggio in un sistema cellulare.
La PCR. Principio di funzionamento. Descrizione dei singoli reagenti necessari. Visualizzazione del prodotto di PCR. Elettroforesi su gel d’agarosio. Problema delle contaminazioni. Marcatura dei prodotti di PCR: saggi diretti e indiretti. Aggiunta di code al 5’. Applicazioni della PCR. Il disegno dei primers. La Tm dei primers. Hairpin, self-dimers e Dimer. Primers design tools. Dimostrazioni pratiche.
Varianti comuni della PCR. Multiplex PCR. Vantaggi e applicazioni. Nested PCR. Applicazioni. Semi-nested PCR. La PCR asimmetrica. Il metodo diretto del sequenziamento di DNA (reazione di Sanger). PCR con primers allele-specifici (ASO e ARMS-PCR). La PCR inversa. PCR hotstart. Touch-down PCR. Long range PCR. Whole-genome amplification (WGA). DOP-PCR. Adaptor-ligation PCR. Inter-Alu PCR. Phi29 DNA-polymerase (MDA). Primers mutagenetici. Un esempio di mutagenesi sito-specifica con primers mutagenetici: il “QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis”.
La quantificazione dell’espressione genica. Il Northern Blot. Valutazione dell’integrità dell’RNA e calcolo della purezza e concentrazione. RT-PCR. Real Time PCR. SYBER e EVA-GREEN. Calcolo della efficienza di reazione. Valutazione della specificità di reazione. Molecular Beacons e Sonde Taqman. Disegno di primers e sonde per real-time PCR. Utilizzo delle giunzioni esone-esone per il posizionamento dei primers in qPCR. Calcolo della quantita’ di espressione con metodo qPCR. Utilizzo di geNorm per la selezione dei geni di riferimento. Quantificazione assoluta e relativa (metodo del Delta-Ct e quantity tranformation; metodo del Delta-Delta-Ct approssimato).
I numeri notevoli dell’RNA. Micro-array per analisi di trascrittomica. Principio di funzionamento. Microarray spottati a cDNA, a oligonucleotidi pre-sintetizzati, o a oligonucleotidi sintetizzati in situ. Sintesi di sonde nell’array Affymetrix (metodo di stampa fotolitografico). Tipi di sonde: a cDNA, 65-mers e 25-mers. Metodo competitivo a due colori. Metodi a singolo colore. Analisi dei dati. Estrazione degli spot. Eliminazione degli spot con SNR inferiore a 3. Sottrazione del Background. Normalizzazione. Selezione dei geni differenzialmente espressi. Clustering analysis. Applicazioni in ricerca e in diagnostica (Mamma Print).
Nanostring: principio di funzionamento e applicazioni in ricerca e in diagnostica
Biopsie tissutali; biopsie liquide e relative applicazioni; Droplet Digital PCR: aspetti tecnici e applicazioni; analisi a single cell level: utilizzo di strumentazioni come FACS sorting e Laser Capture Microdissection. Analisi a single cell level: RNA scope, tecnologia e applicazioni.
Organizzazione del genoma umano. Categorie di RNA non codificanti: rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, RNA TERT, RNA Y, RNasi MRP, miRNA, siRNA, piRNA.
Sequenze altamente ripetute: retrotrasposoni LINE1 e SINE con particolare riferimento alle sequenze Alu. Sequenze intersperse: retrotrasposoni LTR. Trasposoni a DNA e meccanismo di trasposizione. Conseguenze mutageniche della retrotrasposizione. Pseudogeni processati. DNA satellite. DNA satellite come marker di instabilità citogenetica. Minisatelliti della famiglia telomerica. Minisatelliti della famiglia ipervariabile. Metodi di indagine dei minisatelliti. DNA fingerprinting in genetica forense. Microsatelliti. Evoluzione delle sequenze ripetute in tandem (mini e micro satelliti). Slippage-misalignment.
Micro-satellite instability. Metodi di indagine dei microsatelliti. DNA profiling in genetica forense. Micro-insersioni. Micro-delezioni.
SNPs. Strategie di studio degli SNPs: distinzione tra tecnologie di discovery e tecnologie di genotyping. Strategia di scansione o discovery: metodi conformazionali ed enzimatici. Metodi conformazionali: spiegazione di SSCP, DGGE, dHPLC, HRM tra i metodi conformazionali. CCM e Sanger sequencing tra i metodi enzimatici. Metodi di genotipizzazione: DOT BLOT; RFLP (SOUTHERN BLOT E PCR); ASO PCR; OLA PCR; PIROSEQUENZIAMENTO; MALDI-TOF; TAQ MAN ALLELIC DISCRIMINATION ASSAY.
Genotipizzazione tramite array: APEX; BEAD ARRAY ILLUMIN (GOLDENGATE ASSAY E INFINIUM ASSAY); GENE CHIP AFFYMETRIX.
CNV (duplicazioni; duplicazioni segmentali; delezioni e inversioni); pseudogeni non processati; cenni sulla whole genome duplication; esempi di duplicazioni obbligatorie: i geni delle globine; meccanisimi di formazione alla base delle CNV: non-allelic homologous recombination,ligazione non omologa delle estremità, cromotripsi; implicazioni fisiologiche delle CNV: esempi di polimorfismi in geni implicati nel metabolismo dei farmaci; concetti di farmacogenetica e farmacogenomica; implicazioni patologiche delle CNV: esempi di CNV rilevate in disturbi neurologici; metodiche di analisi delle CNV: TaqMan assay, Digital Droplet PCR, MLPA, QF-PCR.
Comparative Genomic Hybridization (Classical CGH). BAC array CGH, tiling BAC array CGH. SNP array per CGH. Le inversioni segmentali. Un polimorfismo di inversione in 17q21.31
Dal fenotipo al gene. I tratti mendeliani. Identificazione della regione candidata tramite analisi di linkage. Meiosi informative e non informative. Misurare il “contenuto di informazione di un marcatore genetico” (PIC) tramite calcolo della eterozigosita’. Esempi di alberi geneaologici dove capire la “fase gametica” e la prole “ricombinante” e “parentale”. Calcolo del LOD SCORE (mappatura a due punti). Da un singolo marcatore a piu’ marcatori. Il multipoint LOD score. La prima mappa con densita’ elevate dei marcatori umani (CHLC, CEPH). Il multipoint LOD score. La mappatura per i tratti recessivi sfruttando l’autozigosita’. Segmenti cromosomici con “Identity by Descent” (IBD) diversi dai segmenti cromosomici con “Identity by State” (IBS). Esempio di calcolo di LOD score in figli di secondi cugini. Esempi dalla letteratura di mappature per autozigosita’. Possibilita’ di restringere la regione candidata sfruttando l’ancestore comune (esempio della Nijmegen Breakage Syndrome). Clonaggio posizionale, ordinamento dei contigui di cloni e predizione dei loci genici. L’era post-genomica: uso delle banche dati per l’identificazione dei geni nella regione candidata. Geni della regione candidate da sottoporre a screening di mutazione: prioritizzazione sulla base del pattern di espressione, della funzione, delle informazioni provenienti da geni ortologhi e paralogi. L'importanza dei pazienti con anomalie cromosomiche per identificare un gene-malattia. Mutation screening: sequenziamento degli esoni dei geni prioritizzati nei probandi affetti. Analisi parallela del cDNA. Esempi della fibrosi cistica e dell’emofilia grave (fattore VIII). Verifiche all’ipotesi che le mutazioni riscontrate in un probando siano effettivamente causative della patologia: la corrispondenza del modello genetico con la segregazione della mutazione; mutazioni o polimorfismi? Sequenziamento di probandi di famiglie diverse: tre possibili situazioni (stessa mutazione, stesso gene diversa mutazione, nessuna mutazione). Inferire l’effetto funzionale della mutazione (predizione in silico). Identificazione dei geni-malattie con strategie indipendenti dalla posizione: conoscenza del prodotto proteico e utilizzo di modelli animali. Esempi di patologie il cui gene e’ stato rinvenuto tramite clonaggio posizionale: Distrofia muscolare di Dushenne e Fibrosi Cistica.
Genetica e genomica del cancro. Tratti distintivi di una cellula perchè possa essere definita tumorale. Il cancro come un processo multi-stadio. Il cancro come malattia genetica. Oncogeni e oncosoppressori: esempi di mutazioni a carico di queste categorie geniche. Eterogeneità genetica: intratumorale, intermetastatica, intrametastatica, interpaziente. Differenza tra mutazioni passeggere e mutazioni drivers nel cancro e pathways maggiormente coinvolti. Numero e tipologie di mutazioni più frequentemente riscontrate in varie tipologie tumorali. Terapie: dalle convenzionali alle personalizzate. L’esempio del test KRAS. Immunoterapia e definizione di neoantigeni in funzione del carico mutazionale tipico di una cellula tumorale. Visione genomica del cancro. Il Cancer Genome Project.
Storia del Progetto Genoma Umano; Sequenziamento gerarchico; Sequenziamento shotgun; Tecnologia NGS: workflow generale; Metodologie di sequenziamento utilizzate in NGS: sequencing by synthesis; pyrosequencing; proton sequencing; sequencing by ligation; Descrizione della tecnologia NGS con piattaforma Illumina. Descrizione della tecnologia NGS con piattaforma Ion Torrent. Descrizione della tecnologia NGS con piattaforma 454 Roche. Descrizione della tecnologia NGS con piattaforma Solid. Descrizione della tecnologia NGS con piattaforma Helicos. Tecniche di sequenziamento di terza generazione: SMRT (Pacific Bioscience) e Oxoford Nanopore. Analisi bioinformatica dei dati NGS: base calling; allinemaento; variant calling; filtering e annotation. Vantaggi e Svantaggi dell'NGS. Applicazioni dell'NGS in genomica, trascrittomica. epigenomica e matagenomica. Exome sequencing e whole genome sequencing: workflow operativo, analisi bioinformatica ed esempi in letteratura con particolare riferimento alle malattie genetiche rare. RNA sequencing: workflow operativo, analisi bioinformatica e relative applicazioni dell'RNA-seq nell'analisi di espressione genica differenziale, identificazioni di varianti di splicing, identificazioni di trascitti di fusione e analisi allele specifica. Esempi in letteratura. NGS e cancro: pannelli di geni utilizzati in diagnostica. Metagenomica: workflow operativo ed esempi pratici.
Presentation of the course.
Books recommended texts, presentation of the program and the website linked to it.
PCR. Introduction to the principle of operation. Visualization of the PCR product. The design of the primers. The Tm of the primers. Multiplex PCR. The marking of the PCR products. Adding code to 5 '.
The asymmetric PCR. The direct method of DNA sequencing (Sanger reaction). The nested PCR. The semi-nested. The ASO-PCR. The inverse PCR. hotstart PCR. Touch-down PCR. RT-PCR. Long range PCR.
Primers mutagenetici. An example of site-specific mutagenesis with primers mutagenetici: the "Lightning QuickChange Site-Directed Mutagenesis".
Whole-genome amplification (WGA). DOP-PCR. Adaptor ligation-PCR. Inter-Alu PCR. Phi29 DNA-polymerase.
The gene expression quantification. The Northern Blot. The Real-time quantitative (qPCR).
Molecular Beacons and Taqman probes. Using exon-exon junctions for the positioning of the primers in qPCR.
Breaking considerations:
1) the primers need to be unique, verified with BLAST
2) Source of contamination of PCR
Calculating the amount 'of expression qPCR method. relative and absolute quantification (method DeltaDelta-Ct, approximate). Example of using qPCR.
Introduction to digital droplet PCR (ddPCR). Operating principle of ddPCR.
Examples of use. mathematical aspects of ddPCR.
Substantial numbers of RNA. Micro-arrays for transcriptomic analysis. Probe types: a cDNA, 65-mers and 25-mers. competitive method in two colors. single-color methods. Synthesis of Affymetrix array probe (photolithographic printing method). Notes on image processing: background subtraction. Data normalization (Z-score). Pittfalls: specificity 'probes, stringency of hybridization, secondary structures of the probes, uniformity' of the hybridization conditions, retro-transcription of mRNA without amplification (PCR) in order not to distort the relative content of the transcripts.
Outline of clustering methods (hierarchical clustering) two-way (for genes and samples).
Examples of the gene profiling applications: recommended reading by Nature, 403 (6769): 503-511.
Types of genetic polymorphisms. Allele frequencies, the difference between mutations and polymorphisms. Clini of allele frequencies. Minisatellites. Microsatellites. Micro-others auctions. Micro-deletions.
Methods minisatellite investigation. Methods of microsatellite investigation. DNA fingerprinting. DNA profiling in forensic genetics. Evolution of repetitive sequences in tandem (mini and micro satellites).
Micro-satellite instability. Slippage-misalignment. Single nucleotide polymorphisms, micro-others auctions, micro-deletions. Detection methods (discovery and genotyping). of Sanger sequencing reaction. Detection of mutations by dHPLC. Single strand conformation polymorphisms (SSCP).
Genotyped by PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism), ASO-PCR / ARMS (amplification refractory mutation system), oligonucleotide ligation assay, MALDI-TOF, TaqMan Allelic Discrimination Assay, DOT-BLOT. The array genotyping.
Methodical Arrayed Primer Extension Assay (APEX). Genotyped using Illumina BeadArray. The Bead decoding. Genotyping using Affymetrix GeneChip. The pattern of the PM and MM probes.
The segmental duplications. Definition. Segmental duplications constitutive Evolution through whole genome duplication, unequal crossing over and chromosome rearrangement. Pseudogenes.
Examples of polymorphic deletions and duplications: CYP2D6, GSTM1, GSTT1.
Methods to detect deletions / duplications segmental polymorphic or mutant. TaqMan, MLPA, analysis of deletions in the DMD in males. Comparative Genomic Hybridization (CGH Classical). ArrayCGH BAC, BAC tiling arrayCGH. SNP array CGH.
Segmental inversions. An inversion polymorphism in 17q21.31
The main forces shaping allele frequencies in populations.
Droplet Digital PCR and liquid biopsies. Applications for research of rare copies of mutant DNA within mixture of wild-type DNA.
Organization of the genome and other repetitive sequences: The satellite DNA, centromeric heterochromatin, chromosome banding (G and Q).
The telomeric DNA minisatellite, "protein-coding genes" multiple copy, duplicate genes, multi copy genes of RNA (tRNA, rRNA, snoRNAs, snRNA, miRNA), retro-transposons (LINE-1, LINEs).
Mechanism of retrotransposition of LINEs. The SINEs (the Alu sequence)
processed pseudogenes, virus-like elements (retro-transposons LTR), DNA transposons and transposition mechanism.
Step 1a: identification of candidate region through cytogenetic observations (Example: Duchenne muscular dystrophy and cloning by subtraction Kunkel). Cases of diseases "de novo" and analysis of interstitial deletions with high resolution methods (SNP arrays).
Examples of diseases related to interstitial deletions of a single gene or a few genes.
Step 1b: Identification of the candidate region by linkage analysis.
First example of linkage analysis: Huntington's Chorea.
Measure the "information content of a genetic marker" (PIC) by the heterozygosity 'calculation.
Examples of trees where geneaologici understand the "gametic phase" and the offspring "recombinant" and "parental".
Calculation of LOD SCORE (mapping to two points).
From a single marker to more 'markers. The multipoint LOD score. The first map with density 'high human markers (CHLC, CEPH). The multipoint LOD score.
The mapping for recessive traits using the autozigosita '. chromosome segments with "Identity by Descent" (IBD) than homozygosity 'of chromosomal segments with "Identity by State" (IBS). Sample calculation of LOD score in children of second cousins. Relationship between number of generations and IBD segments. Relationship between density 'of the markers and ability' to detect IBD segments. Example of mapping of the cystic fibrosis gene using the ancestral haplotype. ancestral haplotypes and linkage disequilibrium mapping of Cystic Fibrosis.
Summary of the previous lesson (multipoint LOD score). Candidate region identified by mapping autozigosita '. IBD and IBS. Possibility 'to narrow the candidate region using the common ancestor (eg cystic fibrosis and Nijmegen Breakage Syndrome) in closed populations. Examples from the literature of mappings for autozigosita '(see slides).
Example of fine mapping in geneaologici trees (dominance and recessive ').
Identification of candidate region through the use of model animals. ENU-mutagenized mice. Notes on positional cloning, ordering of contiguous clones and prediction of gene loci.
The post-genomic era: use of databases for the identification of genes in the candidate region. Which of the candidate region genes are to be subjected to mutation screening? Prioritization on the basis of the expression pattern, function, the information coming from orthologs and paralogs. Examples: Retinitis Pigmentosa, Marfan syndrome, Beals syndrome, Wilson's disease and Menkes disease. Prioritization also possible on the basis of structural predictions of the protein (functional domains).
Prioritization on the basis of partial information of the protein domains.
Sequencing of exons of the prioritized genes, but not limited to: the cDNA. Examples of cystic fibrosis and severe hemophilia (factor VIII). Tests the hypothesis that mutations identified in a proband are indeed causative of the disease: the correspondence of the genetic model with the segregation of the mutation; mutations or polymorphisms?
Sequencing of probands of different families: what do I expect? Three possible situations (same mutation, the same different gene mutation, no mutation). Inferring the functional effect of the mutation (in silico prediction).
Examples of diseases whose gene and 'was found by positional cloning and examples of diseases where the candidate gene was not immediately expected by the function.
The HGP (Human Genome Project).
clone-by-clone method, "shotgun" method.
The sequencing and re-sequencing of genomes today: the methods of "Next Generation Sequencing" (NGS). "454" system (Roche).
This lesson will not be 'held
The importance of "Depth" and "Coverage".
Graphic illustration of the "reads" mapping a genome browser. uneven coverage of the genome. Relationship of "depth" and fraction of non-sequenced genome. Relationship between number of reads and fraction of the genome not sequenced. Relationship between Depth and Coverage. Relationship between depth and number of "genetic variation" detectable in a genome.
Method NGS Solexa-Illumina. Ion Torrent. NGS methods of single molecule-Pacific Biosciences and Helicos Biosciences. Outline of: whole genome sequencing NGS applications (WGS), exome sequencing, RNA sequencing (RNA-seq). You can use "quantitative" RNA-seq.
NGS: quality reads. RNA-Seq for identifying mRNA isoforms. NGS to detect CNV. The 1000Genomes project. The NHLBI project exome sequencing project. Example mapping for autozigosità by NGS. Exome sequencing and Whole genome sequencing. What information can we understand? The ENCODE project.
The case-control association studies for the study of multifactorial traits. Studies led by a hypothesis: the choice of the selection gene and polymorphism. How to choose cases, how to choose the controls. Examples of "bias" ( "recall bias", "selection bias", "stratification bias").
Errors with the use instead of the prevalence and incidence. Stratification of the population.
Errors in sampling of controls.
calculation of risk by estimating the OR (Odd Ratio) and its confidence intervals.
Possible models of "risk trends ': co-dominant, recessive', dominance.
Limits of association studies.
The meta-analysis as a statistical tool.
Knowing how to interpret a case-control study: association does not mean cause; the importance of knowing the meaning of type I error (alpha).
As an example of ApoE4 allele associated with human disease.
This lesson will not be 'held
Selection of SNPs by genotyping in one association study led by hypothesis (within a candidate gene). Use of linkage disequilibrium. Calculation of the strength of LD between two polymorphisms through D and r2 parameters. The forces that shape variability 'haplotype and modulate the intensity' of linkage disequilibrium. molecular methods and not to define a haplotype. The HapMap Project (www.hapmap.org).
How to extract the haplotype-tagging SNPs.
By candidate genes (hypothesis driven studies) to genome-wide associations studies (GWAS, hypothesis-generating studies).
The Manhattan plot. Example of GWAS to identify locus of susceptibility 'to cancer, in the 8q24 region.
1) Libri di testo consigliati:
"Genetica molecolare umana ", by Tom Strachan & Andrew P. Read (Zanichelli)
"Genetica molecolare umana ", by Tom Strachan & Andrew P. Read (Zanichelli)
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www.stefanolandi.eu
Prova d'esame orale, preceduta da 15 minuti dedicati allo svolgimento di esercizi scritti.
Written exam (2 hours). Oral upon request (it can change the score of + or - 1 point)
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