ECTS - University of Pisa
| Modules | Area | Type | Hours | Teacher(s) | |
| BIOCHIMICA APPLICATA | BIO/10 | LEZIONI | 48 |
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Il corso fornisce allo studente le consocenze relative alle moderne applicazioni della biochimica utlizzate
per la drug discovery, drug delivery, ingegneria proteica per applicazioni cliniche e produzione industriale di target commerciali mediante l'utilizzo di bioreattori ed enzimi modificati e/o immobilizzati su matrici apposite.
In sede d'esame lo studente dovrà dimostrare di essere a conoscenza degli argomenti relativi agli utilizzi applicativi delle conoscenze biochimiche che ci permettono di sfruttare le proteine ed in particolar modo gli enzimi come agenti biologici utilizzabili nelle industrie e nei centri di ricerca.
Al termine del corso lo studente avrà acquisito le competenze di base relative all'utilizzo delle proteine, in special modo di enzimi, nei campi applicativi relativi alle bioconversioni industriali per la produzione di molecole di interesse commerciale, nella quantificazione di molecole in diagnostica clinica e rilevamento di inquinanti ambientali. Lo studente al temine del corso, avrà la capacità di razionalizzare ed interpretare i processi di ricerca applicativi relativi all'individuazione e studio chimico-biologico di un target enzimatico coinvolto nell'eziogenesi di una patologia specifica con l'obbiettivo di applicare su di esso una ricerca mirata di molecole capaci di inibire e/o modulare la sua attività biologica.
Il docente valuta durante la prova d'esame se lo studente ha acquisito le competenze relative alle applicazioni biochimiche presentate durante il corso.
Il corso offre allo studente gli strumenti utili per comprendere come affrontare le problematiche relative alla stabilità chimico-fisica di una proteina, a migliorare l'efficenza della catalisi di una proteina enzimatica, alla sua regolazione mediante effettori/inibitori e modulazione della stabilità del complesso proteina-ligando.
Questa conoscenza è utile per l'utilizzo di proteine e complessi proteina-ligando in ambito industriale e di diagnostica clinica.
The course offers the student useful tools to understand how to deal with problems
related to the maintenance or improvement of the chemical-physical state of a protein,
its regulation by effectors / inhibitors and the modulation of the stability of the
protein-ligand complex. This knowledge is useful for using proteins and protein-ligand
complexes in the industrial field and in clinical diagnostics.
In sede di esame lo studente dovrà dimostrare di conoscere gli aspetti metodologici utilizzati per lo studio di una proteina al fine di renderla utilizzabile in ambiti applicativi di diagnostica clinica e/o produzione commerciale.
The student will be asked during the examination which strategies are used in the biochemical field to regulate the catalytic capacities of an enzyme, the protein attitude in the interaction with its ligand and the most commonly used strategies for drug discovery and drug delivery
Lo studente deve essere a conoscenza di concetti acquisiti con il superamento dell'esame di Biochimica quali struttura e caratteristiche degli amminoacidi, struttura delle proteine, concetti basilari di enzimologia.
The student must be aware of the concepts acquired with passing the Biochemistry exam such as structure and characteristics of amino acids, protein structure, basic concepts of enzymology.
Non richiesti
Not required
Non applicabile
Not applicable
Le lezioni frontali saranno accompagnate da slides che potranno essere successivamente scaricate sul portale e-learning.
The lectures will be accompanied by slides that can be subsequently downloaded on the appropriate site.
Interazione proteina ligando: considerazioni generali. definizione della costante di dissociazione e associazione. Valutazione IC50 ed EC50. Proteine a siti multipli non dipendenti equivalenti e non equivalenti. Proteine a siti multipli dipendenti. Equazione di Adair.
Valutazione delle interazioni aspecifiche. Metodi grafici per la determinazione della Kd. metodi per la determinazione della concentrazione del complesso enzima-ligando. Dialisi all'equilibrio. utilizzo della metodica di ultrafiltrazione. Cromatografia per gel filtrazione, cromatografia frontale.
Cromatografia affinità per la valutazione interazione proteina ligando. Ligandi cromofori e fluorofori. Complesso ternario per ottenere interazione tra proteine. Bioconversioni: Aspetti generali. Vantaggi e svantaggi delle
Uso di enzimi in soluzione nell'industria chimica e farmaceutica: Metionina gamma liasi e cisteina desulfidrilasi. Produzione in ambito industriale di amminoacidi: esempi. Purine e pirimidine: aspetti generali e loro utilizzo come agenti antivirali e antineoplastici. Sintesi inosina marcata uniformemente nella porzione ribosidica.
Metodiche di immobilizzazione di enzimi: metodi fisici e metodi chimici. Attivazione dei supporti nella immobilizzazione covalente. Immobilizzazione cross-link. Immobilizzazione della tripsina.
Immobilizzazione dell'ureasi e amilasi. Utilizzo degli enzimi coinvolti nel catabolismo dell'amido, cellulosa, emicellulosa e lignina: applicazioni industriali.
Enzimi applicati all'industria alimentare: fitasi, lipasi e lattasi. Bioreattori utilizzati per l'idrolisi del lattato. Biosensori, aspetti generali. Classificazione dei biosensori. Biosensori amperometrici. Biosensori di prima e seconda generazione
Cenni biosensore di terza generazione. Biosensori utilizzati in diagnostica clinica. Amplificazione del segnale. Biosensori ottici per la determinazione di ossigeno, glucosio e lisina. Biosensore per la determinazione dei metalli pesanti.
Biosensori enzimatici per la rilevazione dei pesticidi. Biosensore multi-enzimatico per la valutazione della qualità del refluo. Indice di impatto della funzionalità enzimatica. Biosensore non enzimatico per la rilevazione di erbicidi e metalli. Biosensore non enzimatico per la valutazione del
Fattori che possono indurre perdita dell'attività biologica di una proteina. Organismi estremofili. Esperimento di Anfinsen. Patologie correlate alla denaturazione proteica. Chaperon molecolari: caratteristiche generali. Un esempio di Hsp60: il sistema di GroE di E.Coli ed il suo funzionamento. Altri esempi di chaperons molecolari: Hsp70, Hsp90 e Hsp100. Small heat schock protein. Utilizzo chaperons molecolari per eliminare aggregazione proteica durante sovra-espressione della proteina di interesse. Ruolo fisiologico del cristallino. Proteine cristalline: alfa cristalline. Caratteristiche generali.
Struttura delle alpha cristalline. Modelli dei complessi oligomerici. Azione delle Alpha cristalline come chaperon molecolari in collaborazioni con altri chaperon. Ruolo protettivo delle Alpha cristalline in relazione alla precipitazione e inattivazione enzimatica. Trigger factor. Utilizzo di un bioreattore contenente chaperons molecolari. Utilizzo di molecole inibenti l'azione degli chaperon. Stress ossidativo. Specie radicaliche dell'ossigeno (ROS) e loro effetti sulle funzionalità cellulari. Meccanismi di detossificazione da ROS enzima dipendenti: superossido dismutasi, catalasi e glutatione perossidasi. Meccanismi di detossificazione da ROS enzima indipendenti: acido ascorbico, tocoferolo, glutatione. Anabolismo e catabolismo del glutatione. Funzionalità del glutatione. Glutatione reduttasi e transferasi. Proteine deputati allo stoccaggio e trasporto dell'atomo di ferro.
Aspetti biochimici del drug discovery. Ricerca, sviluppo e diffusione di un farmaco. Trials clinici. Complesso della Tioredossina/Tioredossina Reduttasi: struttura e ruolo fisiologico. Drug discovery della Tioredossina Reduttasi.
Schistosomiasi e ruolo della tioredossina glutatione reduttasi di Schistosoma nell'insorgenza della malattia. Drug discovery della tioredossina glutatione reduttasi di Schistosoma: screening di inibitori in vitro e loro caratterizzazione, prove della loro efficacia in vivo. Tripanotione. Sintesi e ruolo fisiologico. Tripanotione Reduttasi. Drug discovery della Tripanotione Reduttasi: ricerca di inibitori dell'enzima come strategia per la cura dalla Tripanosomiasi. Screening combinato in vitro e in vivo per la ricerca di inibitori della Tripanotione Reduttasi. Drug discovery combinata in vitro e in vivo: aspetti applicativi. Mutazioni sito specifiche delle proteine. Direct evolution proteico. Insulina: struttura e ruolo fisiologico. Forma monomerica ed esamerica dell'insulina. Tipologie di insulina in base alle tempistiche d'azione. Mutazioni sito specifiche dell'insulina: aspartato insulina, insulina lys-pro. Insulina AspB10 come insulina a risposta ultrarapida e fattore mitogenico in correlazione con IGF1. Insulina ultrarapida: Glargina, Detemir, Glutadec. Mutazioni sito-specifiche su enzimi utilizzati nelle industrie: glucosio isomerasi, beta-glucosidasi, subtilisina. Mutazioni sito-specifiche: fenilalanina ammonia-liasi, laccasi. Dalla patologia all'identificazione del target biologico. Enzima come target biologico. Le complicanze del diabete:la cataratta. Stress osmotico sorbitolo dipendente. Aldoso reduttasi di tipo 2 (ALR2): caratteristiche generali. Coinvolgimento di ALR2 nell'insorgenza della cataratta diabetica. Utilizzo linee transgeniche murine per valutare la correlazione tra l'insorgenza della cataratta e l'espressione dell'Aldoso Reduttasi. Cataratta indotta da Streptozotocina e da Mafatalene. Stress glicativo e ossidativo associato alla Via dei Polioli. Mutanti sito-specifici per valutare il meccanismo catalitico dell'Aldoso Reduttasi e la presenza di cisteine sensibili alla variazione dello stato redox della cellula.
Attività dell'enzima Aldoso Reduttasi modificata da tioli. Effetto dell'incubazione con il glutatione disolfuro sull'attività dell'enzima e nella variazione del profilo di eluizione relativo alla colonna per affinità. Effetto dell'ossigeno iperbarico sull'attività dell'Aldoso reduttasi in estratti di lente. Inattivazione dell'Aldoso Reduttasi da HNE. Effetto del rame sull'attività dell'Aldoso Reduttasi. Formazione ponti disolfuro nell'Aldoso Reduttasi indotta dal rame. Ruolo del GS-DHN nella risposta infiammatoria. Correlazione tra l'Aldoso Reduttasi e l'attivazione delle cellule della Microglia e nell'insorgenza dell'infiammazione nelle cellule epiteliali della lente.
Danno cellulare indotto da acroleina e correlazione con l'Aldoso reduttasi. Inibitori dell'Aldoso Reduttasi: inibitori di nuova sintesi e di origine naturale. Inibitori differenziali dell'Aldoso Reduttasi. Inibitori dell'Aldoso Reduttasi quali potenziali farmaci anticatarattici: effetto del trattamento topico. Ruolo della Piruvato Deidrogenasi Kinasi nel metabolismo cellulare. Effetto Warburg. Drug discovery relativo alla Piruvato Deidrogenasi Chinasi. Inibizione covalente.
Topics covered in the course and methods of examination. Ligand protein interactions.The association and dissociation constant of the protein-ligand complex.Presence of multiple non-equivalent binding sites. Evaluation of non-specific interactions. Graphical methods for Kd determination. Methods for determining the concentration of the protein-ligand complex. Overview of spectroscopic methods. Dialysis at equilibrium. Gel filtration chromatography, frontal chromatography. Use of enzymatic catalysis: general considerations. Synthesis of N-acyl-D-amino acids, S-derivatives of L-amino acids and alpha-keto acids. Phosphorylases for the synthesis of nucleoside and nucleotide derivatives. Immobilization of enzymes. Inosine synthesis marked on ribosidic portion. Enzyme immobilization methods: physical methods and chemical methods. Covalent immobilization; the activation phase of the support. Cross-linking. Effect of charges present on the support on the activity of the immobilized enzyme. Factors that can determine the loss of activity of an enzyme. The acquisition and maintenance of the correct folding: from the Anfinsen experiment to the molecular chaperones. The chaperone activity of the peptidylprolyl isomerase and the disulfide isomerase protein. The Hsp classes An example of Hsp60: E.coli's GroE system and its operation. Molecular chaperones: Examples of Hsp90 and Hsp70. The DnaK cycle and the role of Hsp90 in the maturation of steroid hormone receptors. The small heat shock protein: the example of alpha crystalline.
The alpha crystalline molecular chaperone in collaboration with other chaperones. Biotechnological application of molecular chaperones. The chaperone activity of the peptidylprolyl isomerase and the disulfide isomerase protein. The Hsp classes An example of Hsp60: E.coli's GroE system and its operation. Molecular chaperones: Examples of Hsp90 and Hsp70. The DnaK cycle and the role of Hsp90 in the maturation of steroid hormone receptors. The small heat shock protein: the example of alpha crystalline. The alpha crystalline molecular chaperone in collaboration with other chaperones. Biotechnological application of molecular chaperones Oxidative stress and antioxidant defenses of cells. Employent and independent enzyme detoxification mechanisms. Structure and function of glutathione Biosensors, general aspects. Biosensors used in clinical diagnostics. Biosensor for the determination of glucose, cholesterol, urea. Biosensors of first, second and third generation. Possibility of signal amplification. Biosensor for dependent metal enzymes Optical biosensors. Biosensor Lysine oxidase. Biosensors for pesticide determination. Biosensors containing immobilized algae. Biosensor for the evaluation of B.O.D. Brief affinity biosensors. Multienzymatic biosensor for the determination of fluid quality, introductory aspects. Multi-enzyme sensor for the evaluation of fluid quality. The site specific mutation: general aspects. Insulin: structure, biosynthesis and physiological role. Specific site mutations regarding insulin.Insulin Lys-Pro, Insulin AspB10 and examples of long-acting insulin. Specific site mutations: the example of glucose isomerase, glucosidase, subtilisin, phenylalanine, ammonia lyase. Biochemical foundations of Drug Discovery. Combinatorial chemistry techniques. Thioredoxin and thioredoxin reductase: structure and biological function. Synthetic and natural inhibitors of thioredoxin reductase: examples. Schistosomiasis. Thioredoxin Reductase inhibitors as drugs for therapy against Schistosoma diseases. Trypanosoma. Example of drugs against trypanosome diseases. The role of the Tripanotione. Research of Tripanotione Reductase inhibitors through in vitro and in silico methods Use of enzymes in the industrial field. Examples of enzymes involved in the degradation of food fibers, starch, phytic acid, polyphenols. Bioreactor for lactose hydrolysis. Use of hemicellulose for the production of biobutanol. Aldose Reductase type 2 (AKR1B1): general characteristics. Involvement of the polyol pathway in diabetic complications. Hyperosmotic model. Use of transgenic mouse lines for the study of diabetic cataracts. Involvement of AKR1B1 in the Naftalene-induced cataract. Definition of the reaction mechanism of the enzyme Aldoso Reductase by site-specific modification. Ruler of C298. Thiol-dependent modification of the Aldose reductase. Aloe-reductase modification from physiological disulphides. Effect of hyperbaric oxygen on the activity of the enzyme. Inactivation of the Aldose reductase by HNE and its oxidative modification by copper ion. Inhibitors of the Aldose Reductase type 2: classification. Tricyclic pyridazinones as selective inhibitors of the enzyme. Aloe reductase inhibitors as potential anti-cancer drugs: effect of topical treatment. Involvement of Aldose Reductase in the inflammatory response: correlation between Aldose reductase and activation of microglia cells, lens epithelial cells and macrophages. Role of Aldosa reductase in acrolein-mediated inflammation. Differential inhibitors of Aldose reductase. Role of Pyruvate Dehydrogenase Kinase in the onset of oncogenesis. Covalent inhibitors of Pyruvate Dehydrogenase Kinase. Role of Purines and Pyrimidines in the life cycle of an organism.
Materiale didattico: slides presentate durante le lezioni frontali.
Articoli scientifici su richiesta dello studente.
Teaching material: slides presented during the lectures. scientific articles
nessuna indicazione
not present
prova orale finale
oral exam
Non previsti
Not provided
non applicabile
not present
nessuna
none
