CdSCHIMICA
Codice354CC
CFU3
PeriodoPrimo semestre
LinguaItaliano
| Moduli | Settore/i | Tipo | Ore | Docente/i | |
| METODOLOGIE CHIMICHE, BIOCHIMICHE E BIOANALITICHE PER LO STUDIO DELLE PROTEINE | CHIM/01 | LEZIONI | 24 |
|
Il corso si propone di fornire un approccio integrato multi-tecnica per l’analisi di proteine in matrici biologiche complesse. La scelta della tipologia di analita, le proteine, è dovuta alla vastità
delle problematiche analitiche ad esse connesse in chimica clinica, ambientale, chimica degli alimenti,
farmaceutica, chimica dei beni culturali, biotecnologie e chimica forense provenienti dal mondo della ricerca e dell’industria.
L’obiettivo del corso è quello di fornire allo studente le conoscenze per scegliere la metodologia di
conservazione, trattamento del campione proteico e la tecnica analitica più idonea per l’ottenimento di dati affidabili compatibilmente con l’obiettivo da raggiungere (preparativo o analitico).
Tale obiettivo verrà raggiunto attraverso la trattazione degli argomenti di seguito elencati associata alla scelta delle tecniche analitiche strumentali necessarie per applicazioni a problematiche reali.
Manipolazione dei campioni biologici per l’analisi di proteine in matrici biologiche complesse:
campionamento e conservazione. Dissociazione, denaturazione reversibile/irreversibile delle proteine. Agenti salting in, salting out. Tensione superficiale delle proteine. Unfolding e aggregazione proteica: principi e tecniche di studio. Metodi di identificazione, purificazione, separazione.
Turbidometria, fluorescenza, test della tioflavina T e del Rosso Congo. Studio dell’idrofobicità: ANS binding assay. I saggi enzimatici per la determinazione di proteine e substrati in chimica bioanalitica.
Sequenziamento, western blotting, immunoblotting, e degradazione di Edman, spettrometria di massa. Dynamic light scattering (DLS) e size exclusion chromatography (SEC). Tensione superficiale (DSTD). Tecniche ifenate.
This course will give the student an overview of an integrated multi-technique approach for the analysis of proteins in complex biological matrices. The choice of the type of analyte, proteins, is due to the vastness of the analytical problems connected to them in clinical chemistry, environmental, food chemistry, pharmaceutical, cultural heritage chemistry, biotechnology and forensic chemistry from the world of research and industry.
The aim of the course is to provide the student with the knowledge to choose the conservation methodology, treatment of the protein sample and the most suitable analytical technique for obtaining reliable data compatibly with the objective to be achieved (preparative or analytical).
This training objective will be achieved through the discussion of the topics listed below associated with the choice of instrumental analytical techniques necessary for applications to real problems.
Handling of biological samples for the analysis of proteins in complex biological matrices: sampling and conservation. Dissociation, reversible / irreversible denaturation of proteins. Salting in, salting out. Surface tension of proteins. Unfolding and protein aggregation: principles and techniques. Identification, purification and separation methods. Turbidometry, fluorescence, thioflavin T and Congo Red tests. Hydrophobicity study: ANS binding assay. Enzymatic assays for the determination of proteins and substrates in bioanalytical chemistry. Sequencing, western blotting, immunoblotting, and Edman degradation, mass spectrometry. Dynamic light scattering (DLS). Surface tension (DSTD). Hyphenated techniques.
Accertamento delle conoscenze attraverso feedbacks durante le lezioni
Ongoing assessment to monitor academic progress through oral feedbacks during lessons
Lo studente sarà in grado di affrontare il problema analitico di trattamento di un campione proteico in base alle finalità della ricerca analitica (identificazione, purificazione, quantificazione, caratterizzazione strutturale).
Students will konw how to handle a proteic sample from the analytical point of view depending on the aim of the research (identification, purification, quantification, structural characterization).
- Lo studente potrà (opzionale) preparare e presentare con slides la parte materilai e metodi di un articolo di suo interesse riguardante la preparazione ed analisi di un campione proteico
The student may (optional) prepare and present with slides the experimental part of a scientific article of his/her interest concerning the preparation and analysis of a protein sample
- Lo studente potrà acquisire sensibilità e conoscenze nella scelta del trattamento del campione proteico a scopi analitici e/o preparativi.
- Lo studente potrà essere in grado di scegliere le tecniche adeguate per la caratterizzazione delle proteine in campioni biologici complessi.
- Lo studente potrà essere in grado di orientarsi nella lettura e comprensione della parte sperimentale e dei risultati di articoli scientifici al fine di adattare le metodologie al proprio problema analitico.
- The student will be able to acquire sensitivity and knowledge in the choice of the treatment of the protein sample for analytical and / or preparatory purposes.
- The student will be able to choose the appropriate techniques for the characterization of proteins in complex biological samples.
- The student will be able to orient himself in reading and understanding the experimental part and the results of scientific articles in order to adapt the methodologies to his own analytical problem.
Durante le lezioni saranno richiesti brevi feedbacks concernenti gli argomenti trattati
- During the sessions brief feedbacks related to the topics developed will be evaluated
- Struttura e proprietà generale degli aminoacidi, stereoisomeri e attività ottica. Gli aminoacidi come anfoliti. Punto isoelettrico, pKCOOH e pKNH2, pK dei gruppi laterali degli amminoacidi. Classificazione degli amminoacidi aminoacidi in base alle proprietà della catena carboniosa. Idrofobicità, idrofilicità. Effetto idrofobico. Il legame peptidico. La struttura primaria delle proteine: importanza biologica e applicativa. Struttura secondaria delle proteine. Struttura terziaria. Struttura quaternaria e significato funzionale.
- Proprietà spettroscopiche. UV visibile. I cromofori. Determinazione quantitativa delle proteine mediante assorbanza. I cofattori. Metodi di dosaggio delle proteine in campioni biologici. Fluorescenza molecolare delle proteine. Cromofori intrinseci e tagging.
- Denaturazione delle proteine: agenti denaturanti fisici (calore, ultrasuoni, pressione, interfacce) e chimici (pH, agenti salting in caotropici, solventi organici, detergenti). Tecniche per lo studio dell'unfolding. Serie di Hofmaister (agenti salting in e salting put). Molten globule. Precipitazione, aggregazione.
- Preparazione del campione: vari metodi di omogenizzazione, precipitazione, purificazione. Tecniche elettroforetiche. Tecniche di separazione bidimensionale: isoelettrofocalizzazione, PAGE, SDS-PAGE. Tecniche di blotting: Western blotting.Diagramma di flusso del protocollo analitico generale per la determinazione di proteine da materiale biologico. Esempi
- Proteine speciali:gli anticorpi ed enzimi. Reazioni antigene-anticorpo. Anticorpi monoclonali e policlonali. Tecniche di immunometria. Immunofluorescenza. Labelling. Vantaggi e svantaggi dei metodi immunoenzimatici. Metodi competitivi e non competitivi etrogenei (test ELISA). Test competitivi e non competitivi omogenei. Vantaggi in chimica clinica e in chimica analitica. Enzimologia e saggi enzimatici. Equazione di Michaelis-Menten: utilizzo nei saggi per la determinazione del substrato o dell'enzima.
- Saggi enzimatici (II parte). Determinazione del substrato mediante saggio a punto finale e mediante velocità iniziale. Saggi continui e discontinui. Vantaggie e limiti. Come si esegue praticamente un saggio enzimatico: procedure e strumentazione. Tecniche ifenate applicate allo studio delle proteine: protein labelling.
- Tecniche ifenate (continua). Studio della tensione superficiale delle proteine: metodi convenzionali e rivelatore dinamico di tensione superficiale. Alcuni esempi per lo studio della denaturazione proteica.
- Tecniche per lo studio della struttura secondaria delle proteine: spettroscopia FTIR. Strumentazione e metodi di preparazione del campione proteico solido o in soluzione acquosa. Analisi in trasmissione e ATR. Dallo spettro FTIR alla determinazione della struttura secondari: importanza della bande Ammide I. Analisi qualitativa e quantitativa della struttura secondaria. Limiti e vantaggi dell'FTIR per lo studio della conformazione delle proteine. Alcuni esempi.
- Spettroscopia Raman e SERS (Dr Beatrice Campanella). Confronto Raman/IR. Strumentazione Raman. Spettro Raman degli amminoacidi e delle proteine. La banda Ammide I, Ammide II e lo stretching S-S. Gli amminoacidi aromatici. Come l'ambiente influenza lo spettro Raman delle proteine. Alcuni esempi. Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).
- Tecniche per lo studio della struttura secondaria delle proteine (II): Dicroismo Circolare. Lo spettro CD delle proteine. Cristallografia a raggi X. Medoti di cristallizzazione delle proteine. Confronto tra i vari metodi: limiti e vantaggi.
- Spettrometria di massa e proteomica (I). La spettrometria si massa nelle scienze «omiche».Tecniche di ionizzazione hard e soft. ESI, MALDI. Gli analizzatori.Preparazione del campione proteici all'analisi di massa: digestione enzimatica. Gli enzimi proteolitici.
- Spettrometria di massa e proteomica (II). Genoma e proteoma: un gene =una proteina? Non più. Vantaggi della proteomica. Metodi bottom-up e Top down. Un caso reale step-by-step: USO DELL’ANALISI PROTEOMICA DIFFERENZIALE IN FASE LIQUIDA NELLO STUDIO DELL’ESPRESSIONE INDOTTA DA SELENIO E DELLA RESISTENZA AL CISPLATINO.
- Structure and general properties of amino acids, stereoisomers and optical activity. Amino acids as ampholytes. Isoelectric point, pKCOOH and pKNH2, pK of the side groups of amino acids. Classification of amino acids based on the properties of the carbon chain. Hydrophobicity, hydrophilicity. Hydrophobic effect. The peptide bond. The primary structure of proteins: biological and applicative importance. Secondary structure of proteins. Tertiary structure. Quaternary structure and functional meaning.
- Spectroscopic properties. Visible UV. The chromophores. Quantitative determination of proteins by absorbance. The cofactors. Methods for the determination of proteins in biological samples. Molecular fluorescence of proteins. Intrinsic chromophores and tagging.
- Protein denaturation: physical denaturing agents (heat, ultrasound, pressure, interfaces) and chemical (pH, salting agents in chaotropics, organic solvents, detergents). Techniques for the study of unfolding. Hofmaister series (salting in and salting put agents). Molten globules. Precipitation, aggregation.
- Sample preparation: various methods of homogenization, precipitation, purification. Electrophoretic techniques. Two-dimensional separation techniques: isoelectric focusing, PAGE, SDS-PAGE. Blotting techniques: Western blotting. Flow chart of the general analytical protocol for the determination of proteins from biological material. Examples
- Special proteins: antibodies and enzymes. Antigen-antibody reactions. Monoclonal and polyclonal antibodies. Immunometry techniques. Immunofluorescence. Labeling. Advantages and disadvantages of immunoenzymatic methods. Competitive and non-competitive etrogenic methods (ELISA test). Homogeneous competitive and non-competitive tests. Advantages in clinical and analytical chemistry. Enzymology and enzymatic assays. Michaelis-Menten equation: use in assays for substrate or enzyme determination.
- Enzymatic assays (part II). Determination of the substrate by end point assay and by initial velocity. Continuous and discontinuous essays. Advantages and limits. How an enzymatic assay is practically performed: procedures and instrumentation. Hygiene techniques applied to the study of proteins: protein labeling.
- Hygiene techniques (continued). Study of the surface tension of proteins: conventional methods and dynamic surface tension detector. Some examples for the study of protein denaturation.
- Techniques for the study of the secondary structure of proteins: FTIR spectroscopy. Instrumentation and methods of preparation of the solid protein sample or in aqueous solution. Analysis in transmission and ATR. From the FTIR spectrum to the determination of the secondary structure: importance of the Amide I bands. Qualitative and quantitative analysis of the secondary structure. Limitations and advantages of FTIR for the study of protein conformation. Some examples.
- Raman and SERS spectroscopy (Dr Beatrice Campanella). Raman / IR comparison. Raman instrumentation. Raman spectrum of amino acids and proteins. Amide I, Amide II band and S-S stretching. Aromatic amino acids. How the environment affects the Raman spectrum of proteins. Some examples. Surface Enhanced Raman Scattering (SERS).
- Techniques for the study of the secondary structure of proteins (II): Circular dichroism. The CD spectrum of proteins. X-ray crystallography. Protein crystallization methods. Comparison of the various methods: limitations and advantages.
- Mass spectrometry and proteomics (I). Mass spectrometry in the "omics" sciences. Hard and soft ionization techniques. ESI, MALDI. Analyzers. Preparation of the protein sample for mass analysis: enzymatic digestion. The proteolytic enzymes.
- Mass spectrometry and proteomics (II). Genome and proteome: one gene = one protein? Not anymore. Advantages of proteomics. Bottom-up and Top-down methods. A real step-by-step case: USE OF DIFFERENTIAL PROTEOMIC ANALYSIS IN THE LIQUID PHASE IN THE STUDY OF SELENIUM INDUCED EXPRESSION AND RESISTANCE TO CISPLATIN.
Gli studenti non frequentanti sono tenuti a prendere visione del programma svolto. Sono a disposizione sia le slides presentate sia la registrazione delle lezioni.
Slides a disposizione sul sito:
https://polo3.elearning.unipi.it/course/view.php?id=3270
Slides available on the website: https://polo3.elearning.unipi.it/course/view.php?id=3270 and on the MSTeams channel for registered users
Per ulteriori informazioni si prega di contattate per e-mail il docente (bramanti@pi.iccom.cnr.it)