ECTS - University of Pisa
Alla fine del corso, lo studente sarà in grado di:
At the end of the course, the student will be able to:
Il docente verificherà l'apprendimento degli obiettivi intermedi durante lo svolgimento del Corso, attraverso un dialogo diretto con gli studenti sugli argomenti trattati a lezione, e eventualmente attraverso prove in itinere.
The teacher will verify the learning of the intermediate objectives during the course, through a direct dialogue with the students on the topics covered in class, and possibly through ongoing tests.
- the student will be able to recognize the main tools and methods of analysis useful for the study of biological samples
- the student will be able to illustrate how these tools work
- the student will be able to recognize the results produced by the above methods of analysis from a diagnostic / prognostic point of view
- the student will be able to carry out simple tests based on kits on solid support
Durante le lezioni sarà valutata la capacità degli studenti di acquisire criticamente le nozioni esposte dal docente tramite discussioni e approfondimenti legati alle esercitazioni pratiche.
During the lessons, students' ability to critically acquire the concepts presented by the teacher will be assessed through discussions also related to the practical exercises.
Ogni studente è responsabile del rispetto dei più alti standard di integrità accademica. Lo studente dovrà partecipare alle lezioni frontali in modo attivo. Lo studente dovrà sviluppare un approccio appropriato alle norme di un laboratorio di analisi biochimico.
Each student is responsible for adhering to the highest standards of academic integrity. The student must participate actively in the lectures. The student will have to develop an appropriate approach to the standards of a biochemical analysis laboratory.
Durante le lezioni sarà valutata la capacita' degli studenti di acquisire criticamente le nozioni esposte dal docente. Inoltre durante le sessioni di laboratorio saranno valutati il grado di precisione nonchè la capacità operativa e il rispetto delle norme di comportamento.
During the lessons, students' ability to critically acquire the concepts presented by the teacher will be assessed. Furthermore, during the laboratory sessions, the degree of precision will be evaluated as well as the operational capacity and compliance with the rules of conduct.
Conoscenze di base di Biologia cellulare, Biochimica e Biologia Molecolare. In particolare lo studente dovrà avere conoscenze generali sulla fisiopatologia dei principali organi, sulla funzione delle macromolecole proteiche e sul metabolismo glucidico e lipidico.
Basic knowledge of Cell Biology, Biochemistry and Molecular Biology. In particular, the student should have general knowledge on the pathophysiology of the main organs, on the function of proteins, macromolecules and on the glucose and lipid metabolism.
Lezioni teoriche affiancate da esercitazioni pratiche di laboratorio
La frequenza è obbligatoria (70% di frequenza, 30-35% per gli studenti genitori/lavoratori)
Si consiglia allo studente di elaborare e apprendere gradualmente i concetti esposti a lezione durante l'arco del semestre anche attraverso la consultazione di uno dei libri di testo consigliati.
Theoretical lessons accompanied by practical laboratory exercises.
Attendance is compulsory (70% attendance, 30-35% for parent / worker students)
Students are advised to gradually develop and learn the concepts presented in class during the semester, also by consulting one of the recommended textbooks.
Metodi di coltura delle cellule e analisi citofluorimetrica
Metodi di rottura delle cellule:
Omogenizzazione, French Press, sonicazione, metodi meccanici, metodi enzimatici e con l’uso di abrasivi. Importanza e contenuti dei principali tamponi di estrazione.
Tecniche di centrifugazione:
Principi di base della sedimentazione, tipi di rotori (angolo fisso, alloggiamento versticale, bracci oscillanti, elutriatori). Tipi di centruifughe. Tecniche di sedimentazione (differenziale, in gradiente di densita’, per elutriazione). Materiali per gradienti. Ultracentrifughe: generalita’ di utilizzo.
Purificazione e caratterizzazione delle proteine:
Proprieta’ ioniche degli aminoacidi e delle proteine native e in soluzione. Punto isoelettrico. Stabilita’ (termica e in presenza di pH variabile). Criteri di solubilita’ e loro utilizzo per la purificazione delle proteine (frazionamento con sali, solventi organici, PEG, precipitazione isoelettrica). Utilizzo della metodi di quantificazione delle proteine in soluzione: spettrofotometria ottica e all’ultravioletto per la determinazione della concentrazione di campioni proteici, colorazione di Bradford, Lowry.
Tecniche elettroforetiche e di trasferimento su carta, immunoblotting analysis:
Principi generali dell’elettroforesi su matrici solide. Elettroforesi su Gel di agarosio e poliacrilammide (PAGE). Matrici per elettroforesi e loro utilizzo. Elettroforesi su SDS-PAGE. Tipi di tamponi utilizzati per l’analisi PAGE : continui e discontinui. Isoelettrofocusing (IEF) e gel bidimensionali: criteri generali. Generalita’ sull’uso di gel bidimensionali e il loro utilizzo in proteomica e spettrometria di massa (MALDI-TOF).
Western blotting. Tipi di membrane utilizzate e criteri di utilizzo. Rivelazione delle proteine tramite colorazione su gel :Comassie brilliant Blue, Silver staining. Rivelazione delle proteine: tramite colorazione su membrana (Ponceau S) o con anticorpi coniugati ad enzimi o fluorocromi (immunodetection)
Tecniche cromatografiche:
Principi generali di cromatografia (Risoluzione, efficienza, capacità), cromatogramma. Cromatografia su colonna (setaccio molecolare, a scambio ionico, affinita’, idrofobicita’, HPLC, FPLC): generalità d’utilizzo.
Radio-isotopi:
Naturra della radioattivìtà: Tipi di radioattività. Decadimento. Unità di radioattività. Sicurezza. Rivelamento e misura della radioattività: Tubi di Geiger-Muller. Contatori a scintillazione liquida. Uso in biochimica dei radioisotopi. Traccianti.
Tecniche immunologiche:
Anticorpi policlonali e monoclonali, metodi RIA, ELISA, immunodiffusione radiale.
Le analisi Biochimico-Cliniche:
ruolo nella diagnosi, prevenzione e terapia. Campioni utilizzati nell'analisi di laboratorio. Valori normali. Significato di accuratezza e precisione nelle analisi. Variabilità biologica. Preparazione del campione. Metodi di deproteinizzazione.
Proteine
Introduzione al significato della determinazione degli enzimi in biochimica clinica. Classificazione degli enzimi. Determinazione dell'attività (unità) dei principali enzimi plasmatici. Composizione del sangue, ematocrito, velocità di eritrosedimentazione, funzione delle principali proteine plasmatiche. Profilo elettroforetico del siero umano, classsificazione delle globuline, loro funzione e significato del loro dosaggio nelle analisi biochimico cliniche. Immunoglobuline: deficit primitivo e secondario; gammapatie poli e monoclonali. Proteinuria di Bence Jones, crioglobulinemia. Profilo elettroforetico delle iperlipoproteinemie. Emostasi e fattori della coagulazione: fibrinogeno, inibitori della coagulazione, via intrinseca e via estrinseca. Esami di laboratorio per valutare la coagulazione.
Glucidi
Glucosio. Insulina e controllo della glicemia. Classificazione del diabete. Curve da carico e risposta insulinica, prove per la comprensione del significato di iperglicemia. Metodi per la determinazione del glucosio.
Lipidi
Le lipoproteine: classificazione e significato. Determinazione dei lipidi totali, dei trigliceridi e dei fosfolipidi. Colesterolo. Significato metabolico e clinico. Determinazione del colesterolo, del colesterolo esterificato, e del colesterolo HDL. Determinazione acidi grassi non esterificati.
Composti azotati non proteici
Determinazione dell'azoto totale. Determinazione dell'acido urico e significato nelle patologie correlate. Patologie correlate ad alterazione degli amminoacidi. Separazione degli amminoacidi. HPLC degli amminoacidi. Derivatizzazione pre-colonna degli amminoacidi. Creatina e fosfocreatina. Metabolismo energetico e formazione di creatinina. Determinazione creatina e creatinina. Clearance della creatinina.
Omeostasi del calcio e fattori che la influenzano PTH, calcitonina, vitamina D. Cause di ipoaclcemia e ipercalcemia. Metodi di determinazione del calcio plasmatico. Ruolo fisiologica, determinazione e significato clinico del ferro.
Esame delle urine, esame de sedimento urinario, clearance renale, velocità filtrazione glomerulare. Flusso plasmatico renale, determinazione acido p-aminoippurico. Classificazione, significato clinico, determinazione dei markers tumorali
Il corso prevede inoltre 7 esercitazioni di laboratorio:
Cell culture methods and flow cytometric analysis
Cell breakdown methods:
Homogenization, French Press, sonication, mechanical methods, enzymatic methods and with the use of abrasives. Importance and contents of the main extraction buffers.
Centrifugation techniques:
Basic principles of sedimentation, types of rotors (fixed angle, vertical housing, oscillating arms, elutriators). Types of centrifuge. Sedimentation techniques (differential, in density gradient, by elutriation). Gradient materials. Ultracentrifuges: general use.
Protein purification and characterization:
Ionic properties of amino acids. Isoelectric point. Stability (thermal and in the presence of variable pH). Solubility criteria and their use for the purification of proteins (fractionation with salts, organic solvents, PEG, isoelectric precipitation). Use of the methods for quantifying proteins in solution: optical and ultraviolet spectrophotometry for determining the concentration of protein samples, Bradford, Lowry staining.
Electrophoretic and paper transfer techniques, immunoblotting analysis:
General principles of electrophoresis on solid matrices. Agarose and Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE). Matrices for electrophoresis and their use. Electrophoresis on SDS-PAGE. Types of swabs used for PAGE analysis: continuous and discontinuous. Isoelettrofocusing (IEF) and two-dimensional gels: general criteria. General information on the use of two-dimensional gels and their use in proteomics and mass spectrometry (MALDI-TOF).
Western blotting. Types of membranes used and usage criteria. Detection of proteins by gel staining: Comassie brilliant Blue, Silver staining. Protein detection: by membrane staining (Ponceau S) or with antibodies conjugated to enzymes or fluorochromes (immunodetection)
Chromatographic techniques:
General principles of chromatography (resolution, efficiency, capacity), chromatogram. Column chromatography (molecular sieve, ion exchange, affinity, hydrophobicity, HPLC, FPLC): general information on use.
Radio-isotopes:
Nature of radioactivity: Types of radioactivity. Decay. Radioactivity unit. Safety. Detection and measurement of radioactivity: Geiger-Muller tubes. Liquid scintillation counters. Use of radioisotopes in biochemistry. Tracers.
Immunological techniques:
Polyclonal and monoclonal antibodies, RIA methods, ELISA, radial immunodiffusion.
Clinical biochemistry:
role of biomarkers in diagnosis, prevention and therapy. Samples used in the laboratory analysis. Normal values. Meaning of accuracy and precision in the analysis results. Biological variability. Sample preparation. Methods of deproteinization.
Proteins
Introduction to the significance of enzyme determination in clinical biochemistry. Classification of enzymes. Determination of the activity (units) of the main plasma enzymes. Blood composition, haematocrit, erythrocyte sedimentation rate, function of the main plasma proteins. Electrophoretic profile of human serum, classification of globulins, their function and significance of their dosage in clinical biochemical analysis. Immunoglobulins: primary and secondary deficiency. Bence Jones proteinuria, cryoglobulinemia. Electrophoretic profile of hyperlipoproteinemia. Haemostasis and coagulation factors: fibrinogen, coagulation inhibitors, intrinsic and extrinsic pathways. Laboratory tests to evaluate clotting.
Glucides
Glucose. Insulin and blood glucose control. Diabetes classification. Load curves and insulin response, evidence for understanding the meaning of hyperglycemia. Methods for the determination of glucose.
Lipids
Lipoproteins: classification and meaning. Determination of total lipids, triglycerides and phospholipids. Cholesterol. Metabolic and clinical significance. Determination of cholesterol, esterified cholesterol, and HDL cholesterol. Determination of non-esterified fatty acids.
Non-protein nitrogen compounds
Determination of total nitrogen. Determination of uric acid and its significance in related pathologies. Pathologies related to alteration of amino acids. Separation of amino acids. HPLC of amino acids. Pre-column derivatization of amino acids. Creatine and phosphocreatine. Energy metabolism and creatinine formation. Creatine and creatinine determination. Creatinine clearance.
Calcium homeostasis and factors affecting it PTH, calcitonin, vitamin D. Causes of hypoaclcemia and hypercalcemia. Methods for determining plasma calcium. Physiological role, determination and clinical significance of iron.
Urinalysis, urinary sediment examination, renal clearance, glom filtration rate
The course also includes 7 laboratory exercises:
Sono consigliati i seguenti testi per consultazione:
Wilson K, Goulding K. METODOLOGIE BIOCHIMICHE Raffaello Cortina Editore.
The following texts are recommended for consultation:
Wilson K, Goulding K. METODOLOGIE BIOCHIMICHE Raffaello Cortina Editore (ITA)
Wilson and Walker's PRINCIPLES AND TECHNIQUES OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY Cambridge University Press (ENG)
L’apprendimento sarà valutato tramite prove in itinere (orali o scritte). L’esame negli appelli ufficiale prevede una valutazione orale. Le esercitazioni di laboratorio prevedranno l’approfondimento di un argomento che sarà valutato e contribuirà in modo ponderato al voto finale.
Learning will be assessed through ongoing tests (oral or written). The exam in the official appeals involves an oral evaluation. The laboratory exercises will include in-depth study of a topic that will be evaluated and will contribute in a weighted way to the final grade.
