ECTS - University of Pisa
| Modules | Area | Type | Hours | Teacher(s) | |
| BIOCHIMICA APPLICATA | BIO/10 | LEZIONI | 48 |
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Il corso fornisce allo studente le consocenze relative alle moderne applicazioni della biochimica utlizzate
per la drug discovery, drug delivery, ingegneria proteica per applicazioni cliniche e produzione industriale di target commerciali mediante l'utilizzo di bioreattori ed enzimi modificati e/o immobilizzati su matrici apposite.
The course provides the student with the knowledge related to the modern applications
of the biochemistry used for drug discovery, drug delivery, protein engineering for
clinical applications and industrial production of commercial targets through the use
of bioreactors and modified and / or immobilized enzymes.
In sede d'esame lo studente dovrà dimostrare di essere a conoscenza degli argomenti relativi agli utilizzi applicativi delle conoscenze biochimiche che ci permettono di sfruttare le proteine ed in particolar modo gli enzimi come agenti biologici utilizzabili nelle industrie e nei centri di ricerca.
During the exam, the student must demonstrate knowledge of the topics related
to the application uses of the biochemical knowledge that allow us to exploit proteins
and in particular the enzymes as biological agents that can be used for industrial and
research applications.
Al termine del corso lo studente avrà acquisito le competenze di base relative all'utilizzo delle proteine, in special modo di enzimi, nei campi applicativi relativi alle bioconversioni industriali per la produzione di molecole di interesse commerciale, nella quantificazione di molecole in diagnostica clinica e rilevamento di inquinanti ambientali. Lo studente al temine del corso, avrà la capacità di razionalizzare ed interpretare i processi di ricerca applicativi relativi all'individuazione e studio chimico-biologico di un target enzimatico coinvolto nell'eziogenesi di una patologia specifica con l'obbiettivo di applicare su di esso una ricerca mirata di molecole capaci di inibire e/o modulare la sua attività biologica.
At the end of the course the student will have acquired the basic skills
related to the use of proteins, especially enzymes, in the application fields
related to industrial bioconversions for the production of molecules of commercial interest,
in the quantification of molecules in clinical diagnostics and detection of environmental
pollutants. At the end of the course, the student will have the ability to rationalize
and interpret the application research processes related to the identification and
chemical-biological study of an enzymatic target involved in the etiogenesis of a
specific pathology with the aim of applying a targeted research of molecules able
to inhibit and / or modulate its biological activity.
Il docente valuta durante la prova d'esame se lo studente ha acquisito le competenze relative alle applicazioni biochimiche presentate durante il corso.
The teacher assesses during the exam if the student has acquired the skills
related to the biochemical applications presented during the course.
Il corso offre allo studente gli strumenti utili per comprendere come affrontare le problematiche relative alla stabilità chimico-fisica di una proteina, a migliorare l'efficenza della catalisi di una proteina enzimatica, alla sua regolazione mediante effettori/inibitori e modulazione della stabilità del complesso proteina-ligando.
Questa conoscenza è utile per l'utilizzo di proteine e complessi proteina-ligando in ambito industriale e di diagnostica clinica.
The course offers the student useful tools to understand how to deal with problems
related to the maintenance or improvement of the chemical-physical state of a protein,
its regulation by effectors / inhibitors and the modulation of the stability of the
protein-ligand complex. This knowledge is useful for using proteins and protein-ligand
complexes in the industrial field and in clinical diagnostics.
In sede di esame lo studente dovrà dimostrare di conoscere gli aspetti metodologici utilizzati per lo studio di una proteina al fine di renderla utilizzabile in ambiti applicativi di diagnostica clinica e/o produzione commerciale.
The student will be asked during the examination which strategies are used in the biochemical field to regulate the catalytic capacities of an enzyme, the protein attitude in the interaction with its ligand and the most commonly used strategies for drug discovery and drug delivery
Lo studente deve essere a conoscenza di concetti acquisiti con il superamento dell'esame di Biochimica quali struttura e caratteristiche degli amminoacidi, struttura delle proteine, concetti basilari di enzimologia.
The student must be aware of the concepts acquired with passing the Biochemistry exam such as structure and characteristics of amino acids, protein structure, basic concepts of enzymology.
Le lezioni frontali saranno accompagnate da slides che potranno essere successivamente scaricate sul portale e-learning.
The lectures will be accompanied by slides that can be subsequently downloaded on the appropriate site.
Interazione proteina ligando: considerazioni generali. definizione della costante di dissociazione e associazione. Valutazione IC50 ed EC50. Proteine a siti multipli non dipendenti equivalenti e non equivalenti. Proteine a siti multipli dipendenti. Equazione di Adair.
Valutazione delle interazioni aspecifiche. Metodi grafici per la determinazione della Kd. metodi per la determinazione della concentrazione del complesso enzima-ligando. Dialisi all'equilibrio. utilizzo della metodica di ultrafiltrazione. Cromatografia per gel filtrazione, cromatografia frontale
Cromatografia affinità per la valutazione interazione proteina ligando. Ligandi cromofori e fluorofori. Complesso ternario per ottenere interazione tra proteine. Bioconversioni: Aspetti generali. Vantaggi e svantaggi delle bioconversioni. Acetilazione degli amminoacidi.
Uso di enzimi in soluzione nell'industria chimica e farmaceutica: Metionina gamma liasi e cisteina desulfidrilasi. Produzione in ambito industriale di amminoacidi: esempi. Purine e pirimidine: aspetti generali e loro utilizzo come agenti antivirali e antineoplastici. Sintesi inosina marcata uniformemente nella porzione ribosidica. Metodiche di immobilizzazione di enzimi:metodi fisici e metodi chimici. Attivazione dei supporti nella immobilizzazione covalente. Immobilizzazione cross-link. Immobilizzazione della tripsina. Immobilizzazione dell'ureasi e amilasi. Utilizzo degli enzimi coinvolti nel catabolismo dell'amido, cellulosa, emicellulosa e lignina: applicazioni industriali.
Enzimi applicati all'industria alimentare: fitasi, lipasi e lattasi. Bioreattori utilizzati per l'idrolisi del lattato. Biosensori, aspetti generali. Classificazione dei biosensori. Biosensori amperometrici. Biosensori di prima e seconda generazione
Cenni biosensore di terza generazione. Biosensori utilizzati in diagnostica clinica. Amplificazione del segnale. Biosensori ottici per la determinazione di ossigeno, glucosio e lisina. Biosensore per la determinazione dei metalli pesanti. Valutazione della qualità del refluo. Indice di impatto della funzionalità enzimatica. Biosensore non enzimatico per la rilevazione di erbicidi e metalli. Biosensore non enzimatico per la valutazione del B.O.D. Fattori che possono indurre perdita dell'attività biologica di una proteina. Organismi estremofili. Esperimento di Anfinsen. Patologie correlate alla denaturazione proteica. Chaperon molecolari: caratteristiche generali. Un esempio di Hsp60: il sistema di GroE di E.Coli ed il suo funzionamento.
Altri esempi di chaperons molecolari: Hsp70, Hsp90 e Hsp100. Small heat schock protein. Utilizzo chaperons molecolari per eliminare aggregazione proteica durante sovra-espressione della proteina di interesse. Ruolo fisiologico del cristallino. Proteine cristalline: alfa cristalline. Caratteristiche generali.
Struttura delle alpha cristalline. Modelli dei complessi oligomerici. Azione delle Alpha cristalline come chaperon molecolari in collaborazioni con altri chaperon. Ruolo protettivo delle Alpha cristalline in relazione alla precipitazione e inattivazione enzimatica. Trigger factor. Utilizzo di un bioreattore contenente chaperons molecolari. Utilizzo di molecole inibenti l'azione degli chaperon.
Stress ossidativo. Specie radicaliche dell'ossigeno (ROS) e loro effetti sulle funzionalità cellulari. Meccanismi di detossificazione da ROS enzima dipendenti: superossido dismutasi, catalasi e glutatione perossidasi. Meccanismi di detossificazione da ROS enzima indipendenti: acido ascorbico, tocoferolo, glutatione. Anabolismo e catabolismo del glutatione. Funzionalità del glutatione. Glutatione reduttasi e transferasi. Proteine deputati allo stoccaggio e trasporto dell'atomo di ferro.
Aspetti biochimici del drug discovery. Ricerca, sviluppo e diffusione di un farmaco. Trials clinici. Complesso della Tioredossina/Tioredossina Reduttasi: struttura e ruolo fisiologico. Drug discovery della Tioredossina Reduttasi. Schistosomiasi e ruolo della tioredossina glutatione reduttasi di Schistosoma nell'insorgenza della malattia. Drug discovery della tioredossina glutatione reduttasi di Schistosoma: screening di inibitori in vitro e loro caratterizzazione, prove della loro efficacia in vivo.
Tripanotione. Sintesi e ruolo fisiologico. Tripanotione Reduttasi. Drug discovery della Tripanotione Reduttasi: ricerca di inibitori dell'enzima come strategia per la cura dalla Tripanosomiasi. Screening combinato in vitro e in vivo per la ricerca di inibitori della Tripanotione Reduttasi.
Drug discovery combinata in vitro e in vivo: aspetti applicativi. Mutazioni sito specifiche delle proteine. Direct evolution proteico. Insulina: struttura e ruolo fisiologico. Forma monomerica ed esamerica dell'insulina. Tipologie di insulina in base alle tempistiche d'azione. Mutazioni sito specifiche dell'insulina: aspartato insulina, insulina lys-pro.
Insulina AspB10 come insulina a risposta ultrarapida e fattore mitogenico in correlazione con IGF1. Insulina ad azione lenta: Glargina, Detemir, Glutadec.Mutazioni sito-specifiche su enzimi utilizzati nelle industrie:glucosio isomerasi, beta-glucosidasi, subtilisina.
Mutazioni sito-specifiche:fenilalanina ammonia-liasi, laccasi. Dalla patologia all'identificazione del target biologico. Enzima come target biologico. Le complicanze del diabete:la cataratta. Stress osmotico sorbitolo dipendente. Aldoso reduttasi di tipo 2 (ALR2): caratteristiche generali. Coinvolgimento di ALR2 nell'insorgenza della cataratta diabetica.
Utilizzo linee transgeniche murine per valutare la correlazione tra l'insorgenza della cataratta e l'espressione dell'Aldoso Reduttasi. Cataratta indotta da Streptozotocina e da Mafatalene. Stress glicativo e ossidativo associato alla Via dei Polioli. Mutanti sito-specifici per valutare il meccanismo catalitico dell'Aldoso Reduttasi e la presenza di cisteine sensibili alla variazione dello stato redox della cellula.
Attività dell'enzima Aldoso Reduttasi modificata da tioli. Effetto dell'incubazione con il glutatione disolfuro sull'attività dell'enzima e nella variazione del profilo di eluizione relativo alla colonna per affinità. Effetto dell'ossigeno iperbarico sull'attività dell'Aldoso reduttasi in estratti di lente. Inattivazione dell'Aldoso Reduttasi da HNE.
Effetto del rame sull'attività dell'Aldoso Reduttasi. Formazione ponti disolfuro nell'Aldoso Reduttasi indotta dal rame. Ruolo del GS-DHN nella risposta infiammatoria. Correlazione tra l'Aldoso Reduttasi e l'attivazione delle cellule della Microglia e nell'insorgenza dell'infiammazione nelle cellule epiteliali della lente.
Danno cellulare indotto da acroleina e correlazione con l'Aldoso reduttasi. Inibitori dell'Aldoso Reduttasi: inibitori di nuova sintesi e di origine naturale. Inibitori differenziali dell'Aldoso Reduttasi. Inibitori dell'Aldoso Reduttasi quali potenziali farmaci anticatarattici: effetto del trattamento topico. Ruolo della Piruvato Deidrogenasi Kinasi nel metabolismo cellulare. Effetto Warburg.
Drug discovery relativo alla Piruvato Deidrogenasi Chinasi. Inibizione covalente.
Ligand protein interaction: general considerations. definition of the dissociation and association constant. IC50 and EC50 evaluation. Proteins with multiple not dependent equivalent and non-equivalent sites. Multiple site protein addicts. Adair equation.
Evaluation of non-specific interactions. Graphical methods for determining Kd. methods for determining the concentration of the enzyme-ligand complex. Balance dialysis. use of the ultrafiltration method. Gel filtration chromatography, frontal chromatography
Affinity chromatography for ligand protein interaction evaluation. Chromophoric and fluorophore ligands. Ternary complex to obtain protein interaction. Bioconversions: General aspects. Advantages and disadvantages of bioconversions. Acetylation of amino acids.
Use of enzymes in solution in the chemical and pharmaceutical industry: Methionine gamma lyase and cysteine desulfidase. Production in the industrial field of amino acids: examples. Purines and pyrimidines: general aspects and their use as antiviral and antineoplastic agents. Inosine synthesis uniformly marked in the ribosidic portion. Methods of immobilization of enzymes: physical methods and chemical methods. Activation of supports in covalent immobilization. Cross-link immobilization. Trypsin immobilization. Immobilization of urease and amylase. Use of enzymes involved in the catabolism of starch, cellulose, hemicellulose and lignin: industrial applications.
Enzymes applied to the food industry: phytase, lipase and lactase. Bioreactors used for lactate hydrolysis. Biosensors, general aspects. Classification of biosensors. Amperometric biosensors. First and second generation biosensors
Outline of third generation biosensor. Biosensors used in clinical diagnostics. Signal amplification. Optical biosensors for the determination of oxygen, glucose and lysine. Biosensor for the determination of heavy metals. Evaluation of wastewater quality. Impact index of enzymatic function. Non-enzymatic biosensor for the detection of herbicides and metals. Non-enzymatic biosensor for the evaluation of B.O.D. Factors that can induce loss of biological activity of a protein. Extremophile organisms. Anfinsen experiment. Disorders related to protein denaturation. Molecular chaperons: general characteristics. An example of Hsp60: E.Coli's GroE system and its operation.
Other examples of molecular chaperons: Hsp70, Hsp90 and Hsp100. Small heat schock protein. Use of molecular chaperons to eliminate protein aggregation during over-expression of the protein of interest. Physiological role of the crystalline lens.
Crystalline proteins: alpha crystalline. General features.
Crystal alpha structure. Models of oligomeric complexes. Action of crystalline alphas as molecular chaperones in collaboration with other chaperones. Protective role of crystalline alphas in relation to enzymatic precipitation and inactivation. Trigger factor. Use of a bioreactor containing molecular chaperons. Use of molecules inhibiting the action of chaperones.
Oxidative stress. Radical oxygen species (ROS) and their effects on cellular metabolism. Detoxification mechanisms by ROS enzyme-dependent: superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase. Detoxification mechanisms by ROS enzyme-independent: ascorbic acid, tocopherol, glutathione. Anabolism and catabolism of glutathione. Glutathione function. Glutathione reductase and transferase. Proteins used for the storage and transport of the iron atom.
Biochemical aspects of drug discovery. Research, development and dissemination of a drug. Clinical Trials. Thioredoxin / Thioredoxin reductase complex: physiological structure and role. Drug discovery of Thioredoxin Reductase. Schistosomiasis and role of Schistosoma thioredoxin glutathione reductase in the onset of the disease. Drug discovery of Schistosoma thioredoxin glutathione reductase: screening of in vitro inhibitors and their characterization, evidence of their efficacy in vivo.
Trypanothione. Synthesis and physiological role. Trypanothione Reductase. Drug discovery of Trypanothione Reductase: search for inhibitors of the enzyme as a strategy for treating trypanosomiasis. In vitro and in vivo combined screening for the detection of Trypanothione Reductase inhibitors.
Combined in vitro and in vivo drug discovery: application aspects. Protein-specific site mutations. Direct protein evolution. Insulin: structure and physiological role. Monomeric and hexameric form of insulin. Types of insulin based on the timing of action. Insulin-specific site mutations: aspartate insulin, insulin lys-pro.
Insulin AspB10 as an ultra-rapid response insulin and a mitogenic factor correlating with IGF1. Ultra-low insulin: Glargine, Detemir, Glutadec. Site-specific enzymatic mutations used in industries: glucose isomerase, beta-glucosidase, subtilisin.
Site-specific mutations: phenylalanine ammonia-lyase, laccase. From the pathology to the identification of the biological target. Enzyme as a biological target. The complications of diabetes: the cataract. Sorbitol-dependent osmotic stress. Aldose reductase type 2 (ALR2): general characteristics. Involvement of ALR2 in the onset of diabetic cataract.
Use of murine transgenic lines to evaluate the correlation between the onset of cataract and the expression of the Aldose Reductase. Cataract induced by Streptozotocin and Naphtalene. Glycative and oxidative stress associated with the Poliol pathway. Site-specific mutants to evaluate the catalytic mechanism of the Aldose Reductase and the presence of cysteines sensitive to the change in the cell redox state.
Activity of the enzyme Aldose reductase modified by thiols. Effect of incubation with glutathione disulfide on the activity of the enzyme and in the variation of the elution profile relative to the affinity column. Effect of hyperbaric oxygen on the activity of Aldose reductase in lens extracts. Aldose Reductase inactivation from HNE.
Effect of copper on the Aldose Reductase activity. Formation of disulfide bridges in Adose Reductase induced by copper. Role of GS-DHN in the inflammatory response. Correlation between the Aldose Reductase activity and the activation of Microglia cells and in the onset of inflammation in epithelial lens cells.
Acrolein-induced cell damage and correlation with Aldose reductase. Aldose Reductase inhibitors: newly synthesized and naturally occurring inhibitors. Aldose Reductase Differential inhibitors. Aldose Reductase inhibitors as potential anti-rat drugs: topical treatment effect. Role of Pyruvate Dehydrogenase Kinase in cellular metabolism. Warburg effect.
Drug discovery related to Pyruvate Dehydrogenase Kinase. Covalent inhibition.
Materiale didattico: slides presentate durante le lezioni frontali e pubblicazioni scientifiche inerenti agli argomenti trattati.
Slides and scientific publications related to the topics covered.
nessuna
none
prova orale
oral exam
non presenti
not provided
