ECTS - University of Pisa
Al termine del corso lo studente sarà in grado di conosce e comprende i principi e le applicazioni delle metodologie di indagine biochimica sia per la caratterizzazione della struttura e della funzione delle macromolecole biologiche, sia per la conoscenza dei meccanismi dei processi metaboliche dei fenomeni biologici, anche in rapporto all’azione dei farmaci e dei dispositivi diagnostici per analisi biologiche.
Le attività di laboratorio saranno finalizzate ad avviare gli studenti all’approccio sperimentale e a condurre in modo corretto un esperimento permetterà allo studente di acquisire competenze teorico/pratiche di alcune metodologie applicate nella sperimentazione biochimica e sviluppare autonomia nell'impostazione degli esperimenti e della raccolta dati.
At the end of the course the student will be able to know and understand the principles and applications of biochemical methodologies both for the characterization of the structure and function of biological macromolecules, and for the knowledge of the mechanisms of metabolic processes of biological phenomena, even in relation to the action of drugs and diagnostic devices for biological analysis.
The laboratory activities will be aimed at introducing students to the experimental approach and correctly conducting an experiment will allow the student to acquire theoretical/practical skills of some methodologies applied in biochemical experimentation and develop autonomy in setting up experiments and data collection.
Per l'accertamento delle conoscenze acquisite sarà valutato, durante la discussione in aula e in sede d’esame scritto, la conoscenza dei principali contenuti del corso. Sarà inoltre valutato l'utilizzo di una terminologia appropriata. A tal fine la partecipazione alle lezioni in aula sarà valutata positivamente.
To assess the knowledge acquired, the understanding of the main contents of the course will be assessed during the classroom discussion and during the final written exam, the assessment on the use of the appropriate terminology will be also evaluated. To this end, participation in classroom lessons will be positively evaluated.
Il corso si prepone di dare allo studente la consapevolezza delle operazioni sperimentali proprie delle metodiche utilizzate nella ricerca biochimica per lo studio di struttura e funzione delle macromolecole biologiche. Inoltre, al termine del corso lo studente avrà acquisito la capacità di assumere un comportamento responsabile e critico nello svolgimento delle attività di laboratorio.
The course aims to give to the student an awareness of the experimental procedures used in biochemical research for the study of the structure and function of biological macromolecules. Furthermore, at the end of the course the student will have acquired the ability to assume responsible and critical behavior in carrying out laboratory activities.
Le capacità saranno verificate tramite esercitazioni in laboratorio, eventuali prove in itinere da concordare durante il corso, e nella prova scritta finale. In particolare sarà valutato: la capacità di comprensione dei metodi di analisi; autonomia nello svolgimento delle esercitazioni pratiche tramite anche il rispetto delle normative di sicurezza; capacità di interpretare criticamente i risultati di laboratorio.
Skills will be verified through laboratory exercises and in the final written test. In particular, the following will be assessed: the ability to understand the biochemical assay methods; autonomy in carrying out practical exercises also through compliance with safety regulations; ability to critically interpret laboratory results.
Lo studente acquisirà le conoscenze ed i comportamenti atti a permettergli di svolgere attività di analisi e di ricerca in un laboratorio biochimico.
Students will acquire knowledge and behaviors which will allow to carry out analytical and research activities in a biochemistry laboratory.
Durante la sessione di laboratorio sarà valutato il grado di accuratezza e precisione dell'attività svolte.
During the laboratory stage, students' accuracy and skills will be evaluated.
Sono richieste conoscenze teoriche di biologia cellulare, di chimica e chimica organica, e di biochimica.
The student must possess knowledge of cellular biology, chemistry, organic chemistry, and biochemistry.
Le lezioni saranno tenute in lingua italiana tramite lezioni frontali in aula. Saranno svolte delle ore di esercitazione in aula. La frequenza ai laboratori didattici è obbligatoria. Le tematiche affrontate in aula dovranno essere approfondite tramite lo studio individuale dello studente.
La frequenza è obbligatoria (60-70% delle lezioni; 30% delle lezioni per studenti lavoratori/genitori)
The lessons will be held in Italian through frontal lessons in the classroom. Hours of classroom exercises will be carried out. Attendance at the laboratory is mandatory. The topics addressed in the classroom must be explored in depth through the student's individual study.
Attendance is mandatory (60-70% of lessons; 30% of lessons for working students/parents)
Parte teorica (7 CFU)
Introduzione - Principii della ricerca biochimica. Sperimentazione biochimica.
Tecniche preparative
Colture cellulari eucariotiche: strumentazione di base di un laboratorio di colture cellulari (cappe a flusso laminare, incubatori). Colture cellulari primarie e linee cellulari. Terreni di coltura e tecniche di coltura. Tecniche di trasfezione cellulare
Preparazione di campioni da tessuti biologici: Scelta del tampone. Omogeneizzazione (scelta delle metodiche e dei media). Richiami di spettroscopia UV-Vis, legge di Lambert Beer, strumentazione, cromofori. Dosaggi colorimetrici per la determinazione del contenuto proteico di un campione biologico.
Fluidi biologici e Anticorpi: caratteristiche dei fluidi biologici. Struttura degli anticorpi, reazione antigene-anticorpo. Produzione di antisieri, anticorpi monoclonali. Metodi per dosare anticorpi e antigeni: saggi di immunodiffusione, saggi radioimmunologici (RIA), saggi immunoenzimatici (ELISA).
Tecniche centrifugative (principii della sedimentazione; velocità, RCF, coefficiente di sedimentazione e tempi di sedimentazione). Centrifughe e rotori. Centrifugazione differenziale: separazione e analisi di frazioni subcellulari. Centrifugazione in gradiente di densità, zonale e isopicnica. Applicazioni: separazione di cellule, organelli subcellulari, proteine, acidi nucleici. Valutazione della resa e dell'arricchimento: “marcatori” subcellulari.
Metodiche di purificazione delle proteine: precipitazione frazionata; precipitazione con solventi e polimeri organici; precipitazione al calore. Dialisi ed ultrafiltrazione: principii ed applicazioni. Metodi di purificazione dai corpi di inclusione. Criteri di purezza delle preparazioni proteiche: cristallizzazione, ultracentrifugazione, disc-elettroforesi, curve di solubilità. Ingegnerizzazione di proteine per la purificazione
Tecniche elettroforetiche
Principii generali, fattori che influenzano la mobilità elettroforetica. Elettroforesi su gel: PAGE, PAGE-SDS. Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative. Focalizzazione isoelettrica (IEF). Elettroforesi bidimensionale. Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative. Blotting - Western blotting nello studio delle proteine: applicazioni biochimiche e diagnostiche.
Tecniche cromatografiche
Principii generali, risoluzione e piatti teorici. Tipologie di cromatografia su colonna. Cromatografia liquida ad alta pressione: HPLC.
Dosaggi enzimatici
Metodi di purificazione di enzimi. Richiami di cinetica enzimatica, ed equazione di Michaelis-Menten. Determinazione dell'attività specifica e valutazione della resa di purificazione. Determinazione sperimentale della velocità delle reazioni catalizzate da enzimi: Dosaggio dell'attività enzimatica. Studio dell'inibizione enzimatica: inibitori competitivi, non competitivi e misti. Grafico di Lineweaver-Burk determinazione della Ki.
Tecniche radioisotopiche
Rilevazione e misura della radioattività; utilizzo di molecole radiomarcate in biochimica; studio di proteine di legame mediante ligandi radiomarcati (studi di legame all’equilibrio e studi di competizione).
Tecniche spettrofluorimetriche
Richiami di spettrofluorimetria, resa quantica, decadimento di fluorescenza, strumentazione, cromofori intrinseci ed estrinseci. strumentazione. Uso delle tecniche fluorimetriche nell'analisi qualitativa e quantitativa (linearità della relazione tra l'intensità di fluorescenza e la concentrazione della soluzione, effetto di filtro interno). Applicazione sullo studio dell’interazione delle proteine-proteina, ac nucleico e lipidi (es FRET) e dell’aggregazione proteica (es. ThT)
Tecniche di microscopia
Microscopia ottica e microscopia elettronica. applicazioni biologiche delle tecniche in fluorescenza per la determinazione della localizzazione e delle interazioni molecolari.
Tecniche di spettrocopia di assorbimento in luce polarizzata
Dicroismo circolare: principi di base ed applicazioni per lo studio della struttura della proteine (determinazione del contenuto di alfa elica e foglietto beta). Principi di base del light-scattering e suo utilizzo per lo studio delle dimensioni di particelle (citofluorimetro). Risonanza plasmonica di superficie (SPR): applicazione per lo studio dell’interazione delle biomolecole.
Biologia strutturale
Applicazioni della spettrometria di massa allo studio di macromolecole biologiche. Esempi di applicazione della massa per lo studio/identificazione di un polipeptide. Uso della spettroscopia di massa per la determinazione delle modificazioni indotte sulle proteine: grado di fosforilazione, alchilazione/acetilazione di residui aminoacidici, studio dell'interazione con farmaci ecc. Determinazione della sequenza di proteine (sequenziamento di Edman e mediante spettrometria di massa). Accenni su cristallografia a raggi X, NMR, crio-microscopia elettronica e TEM applicata alla struttura delle macromolecole biologiche.
Tecniche elettrochimiche
Elettrodo ad ossigeno; studi sulla respirazione mitocondriale. Biosensori.
ESERCITAZIONI PRATICHE DI LABORATORIO (2 CFU)
1) Saggi di attività enzimatica: cinetica enzimatica dell’adenosina deaminasi; dosaggio dell’enzima lattico deidrogenasi. 2) Frazionamento subcellulare. 3) Determinazione quantitativa delle proteine totali: metodo del biureto e di Bradford. 4) Separazione elettroforetica di proteine su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti. Western-blot. 5) Purificazione di proteine tramite SEC. 6) Immunodosaggio: ELISA.
Theoretical part (7 CFU)
Introduction - Principles of biochemical research. Biochemical experimentation.
Preparatory techniques
Eukaryotic cell cultures: basic instrumentation of a cell culture laboratory (laminar flow hoods, incubators). Primary cell cultures and cell lines. Culture media and cultivation techniques. Cell transfection techniques
Preparation of samples from biological tissues: Choice of swab. Homogenization (choice of methods and media). Reviews of UV-Vis spectroscopy, Lambert Beer law, instrumentation, chromophores. Colorimetric assays for the determination of the protein content of a biological sample.
Biological fluids and antibodies: characteristics of biological fluids. Structure of antibodies, antigen-antibody reaction. Production of antisera, monoclonal antibodies. Methods for measuring antibodies and antigens: immunodiffusion assays, radioimmunoassays (RIA), enzyme immunoassays (ELISA).
Centrifugal techniques (principles of sedimentation; speed, RCF, sedimentation coefficient and sedimentation times). Centrifuges and rotors. Differential centrifugation: separation and analysis of subcellular fractions. Density gradient, zonal and isopycnic centrifugation. Applications: separation of cells, subcellular organelles, proteins, nucleic acids. Evaluation of yield and enrichment: subcellular “markers”.
Protein purification methods: fractional precipitation; precipitation with solvents and organic polymers; heat precipitation. Dialysis and ultrafiltration: principles and applications. Methods of purification from inclusion bodies. Purity criteria of protein preparations: crystallization, ultracentrifugation, disc electrophoresis, solubility curves. Engineering proteins for purification
Electrophoretic techniques:
General principles, factors influencing electrophoretic mobility. Gel electrophoresis: PAGE, PAGE-SDS. Detection methods and quantitative evaluations. Isoelectric focusing (IEF). Two-dimensional electrophoresis. Detection methods and quantitative evaluations. Blotting - Western blotting in the study of proteins: biochemical and diagnostic applications.
Chromatographic techniques
General principles, resolution and theoretical plates. Types of column chromatography. High pressure liquid chromatography: HPLC.
Enzyme assays.
Enzyme purification methods. Review of enzyme kinetics, and Michaelis-Menten equation. Determination of specific activity and evaluation of purification yield. Experimental determination of the rate of reactions catalyzed by enzymes: Measurement of enzymatic activity. Study of enzyme inhibition: competitive, non-competitive and mixed inhibitors. Lineweaver-Burk plot determination of Ki.
Radioisotopic techniques.
Detection and measurement of radioactivity; use of radiolabeled molecules in biochemistry; study of binding proteins using radiolabeled ligands (equilibrium binding studies and competition studies).
Spectrofluorimetric techniques.
Reviews of spectrofluorimetry, quantum yield, fluorescence decay, instrumentation, intrinsic and extrinsic chromophores. instrumentation. Use of fluorometric techniques in qualitative and quantitative analysis (linearity of the relationship between the fluorescence intensity and the concentration of the solution, internal filter effect). Application on the study of protein-protein, nucleic acid and lipid interaction (e.g. FRET) and protein aggregation (e.g. ThT)
Microscopy techniques
Optical microscopy and electron microscopy. biological applications of fluorescence techniques for the determination of molecular localization and interactions.
Polarized light absorption spectrocopy techniques.
Circular dichroism: basic principles and applications for the study of protein structure (determination of alpha helix and beta sheet content). Basic principles of light-scattering and its use for the study of particle size (flow cytometry). Surface plasmon resonance (SPR): application for studying the interaction of biomolecules.
Structural biology
Applications of mass spectrometry to the study of biological macromolecules. Examples of application of the mass for the study/identification of a polypeptide. Use of mass spectroscopy to determine the modifications induced on proteins: degree of phosphorylation, alkylation/acetylation of amino acid residues, study of the interaction with drugs, etc. Determination of the sequence of proteins (Edman sequencing and by mass spectrometry). Notes on X-ray crystallography, NMR, cryo-electron microscopy and TEM applied to the structure of biological macromolecules.
Electrochemical techniques.
Oxygen electrode; studies on mitochondrial respiration. Biosensors.
PRACTICAL LABORATORY EXERCISES (2 CFU)
1) Enzyme activity assays: enzymatic kinetics of adenosine deaminase; dosage of the lactic dehydrogenase enzyme. 2) Subcellular fractionation. 3) Quantitative determination of total proteins: biuret and Bradford methods. 4) Electrophoretic separation of proteins on polyacrylamide gels under denaturing conditions. Western blot. 5) Purification of proteins by SEC. 6) Immunoassay: ELISA.
Testi consigliati
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L'esame è costituito da una prova finale scritta con domande aperte e/o a risposta multipla su argomenti svolti durante il corso, ed eventualmente delle domande in cui si richiede di svolgere un calcolo che potrebbe essere necessario lavorando in un laboratorio di biochimica. La possibilità di effettuare una/due prove in itinere sui contenuti teorici sarà valutata con gli studenti durante il corso.
L'esame di fine corso mira a verificare e valutare il raggiungimento degli obiettivi didattici:
- conoscere i principi di base delle principali metodologie biochimiche utilizzate nella separazione, identificazione, caratterizzazione ed analisi di biomolecole;
- essere in grado di disegnare o di valutare protocolli sperimentali impiegati nella ricerca biochimica.
Per la parte pratica di laboratorio sarà effettuata una prova scritta contestuale alla prova finale sulla parte teorica del corso che verterà su argomenti affrontati durante tale attività. Tale prova sarà scritta con test a risposta multipla o aperta ed esercizi. La possibilità di effettuare una prova in itinere sui contenuti pratici sarà valutata con gli studenti durante il corso.
Lo studente dovrà ottenere una votazione di almeno 18/30 in entrambe le prove e il voto finale sarà definito dalla media pesata tra il voto del modulo di laboratorio e quello della prova scritta.
The exam consists of a final written test with open and multiple choice questions on topics covered during the course, and possibly questions in which you are asked to carry out a calculation that may be necessary when working in a biochemistry laboratory. The possibility of carrying out one/two ongoing tests on the theoretical contents will be evaluated with the students during the course.
The end-of-course exam aims to verify and evaluate the achievement of the educational objectives:
- know the basic principles of the main biochemical methodologies used in the separation, identification, characterization and analysis of biomolecules;
- be able to design or evaluate experimental protocols used in biochemical research.
For the practical laboratory part, a written test will be carried out at the same time as the final test on the theoretical part of the course which will focus on topics covered during this activity. This test will be written with multiple choice or open questions and exercises. The possibility of carrying out an ongoing test on the practical contents will be evaluated with the students during the course.
The student must obtain a mark of at least 18/30 in both tests and the final mark will be defined by the weighted average between the mark of the laboratory module and that of the written test.
