Modules | Area | Type | Hours | Teacher(s) | |
BIOCHIMICA APPLICATA | BIO/10 | LEZIONI | 84 |
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Lo studente acquisirà conoscenze teoriche e pratiche sulle metodologie e le tecnologie utilizzate nello studio della struttura e della funzione delle macromolecole biologiche.
Per l'accertamento delle conoscenze acquisite saranno svolti sia una prova in itinere scritta al termine dell'attività di laboratorio che un esame finale.
Methods:
Al termine del corso lo studente conescerà e sarà anche in grado di utilizzare varie metodiche per lo studio e la purificazione di proteine ed acidi nucleici.
Durante la sessione di laboratorio gli studenti, suddivisi in gruppi, utilizzeranno metodiche per determinare la concentrazione proteica in un campione biologico, per frazionare un campione, per determinare l'attività enzimatica e ricavarne i parametri all'equilibrio, per separare le proteine e gli acidi nucleici mediante elettroforesi, e per effettuare saggi immunoenzimatici. Al termine del periodo di laboratorio l'acquisizione delle capacità pratiche verrà valutata mediante tests a risposta multipla e/o brevi relazioni.
Lo studente acquisirà le conoscenze ed i comportamenti atti a permettergli di svolgere attività di analisi e di ricerca in un laboratorio biochimico.
Durante la sessione di laboratorio sarà valutato il grado di accuratezza e precisione delle attività svolte.
Sono richieste conoscenze teoriche di biologia cellulare, di chimica e chimica organica, e di biochimica delle macromolecole.
Delivery: face to face
Learning activities:
Attendance: Mandatory
Teaching methods:
Richiami sulla struttura delle cellule eucariotiche e procariotiche. Le colture di cellule eucariotiche, loro separazione, analisi e conteggio.
LE PROTEINE: 1) Estrazione delle proteine da tessuti animali e culture cellulari. Allestimento di omogenati d’organo, di lisati cellulari; frazionamento dei componenti subcellulari. 2) Determinazione quantitativa delle proteine totali: dosaggio dell’azoto proteico, metodi del biureto, di Folin-Ciocalteau, di Lowry; spettrofotometria diretta con applicazione delle formule di Kalckar-Warburg, turbidometria, nefelometria. 3) Determinazione qualitativa e quantitativa delle proteine mediante saggi di attività biologica: a) saggi di attività enzimatica «in vitro», criteri orientativi per la scelta delle condizioni di saggio (temperatura, pH, concentrazione dell’enzima e del substrato, cofattori, tempi di incubazione), calcolo delle unità e dell’attività specifica; b) determinazione immunologica delle proteine: generalità sugli anticorpi mono- e policlonali; saggi di immunodiffusione, saggi radioimmunologici (RIA), saggi immunoenzimatici (ELISA). 4) Tecniche radioisotopiche: rilevazione e misura della radioattività; utilizzo di molecole radiomarcate in biochimica; studio di proteine di legame mediante ligandi radiomarcati (studi di legame all’equilibrio e studi di competizione). 5) Metodi di purificazione delle proteine: precipitazione frazionata al calore, al punto isoelettrico, con solventi organici e sali neutri. Centrifugazione frazionata in mezzo omogeneo ed in gradienti di densità continui e discontinui. Tecniche cromatografiche (gel filtrazione, a scambio ionico, di affinità, cromatografia liquida ad alta pressione); tecniche elettroforetiche: elettroforesi su gel di poliacrilammide (in condizioni native e denaturanti), immunoelettroforesi, elettrofocusing, elettroforesi bidimensionale. Criteri di purezza delle preparazioni proteiche: cristallizzazione, ultracentrifugazione, disc-elettroforesi, curve di solubilità. Ingegnerizzazione di proteine per la purificazione. 6) Determinazione della struttura proteica: analisi di aminoacidi; determinazione della struttura primaria.
GLI ACIDI NUCLEICI 1) Composizione e struttura degli acidi nucleici: DNA e RNA. 2) Isolamento e separazione degli acidi nucleici: separazione dalle macromolecole proteiche mediante fenolizzazione, frazionamento degli acidi nucleici per centrifugazione in gradienti di densità autoformati, per cromatografia ed elettroforesi in gel di agarosio e poliacrilammide. 3) Il comportamento del DNA in soluzione, la denaturazione del DNA, la renaturazione, il punto di fusione. Determinazione spettrofotometrica quantitativa del DNA e RNA. 4) Manipolazione degli acidi nucleici: gli enzimi di restrizione.
TECNICHE AVANZATE: 1) Fluorimetria e spettrofluorimetria: applicazioni. 2) Chemiluminescenza e bioluminescenza: applicazioni. 3) Risonanza Magnetica Nucleare (NMR): applicazioni in biologia. 4) Spettrometria di massa: applicazione allo studio delle proteine. 5) Risonanza plasmonica di superficie (SPR): applicazione per lo studio dell’interazione delle biomolecole.
ESERCITAZIONI PRATICHE DI LABORATORIO: 1) Saggi di attività enzimatica: cinetica enzimatica dell’adenosina deaminasi; dipendenza della cinetica enzimatica dal pH; dosaggio dell’enzima lattico deidrogenasi. 2) Frazionamento subcellulare. 3) Determinazione quantitativa delle proteine totali: metodo del biureto e di Bradford. 4) Separazione elettroforetica di proteine su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti. Western-blot. 5) Separazione elettroforetica del RNA totale su gel di agaroso. 6) Immunodosaggio: ELISA di tipo competitivo od a sandwich.
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L'esame è composto da: