Metodi di coltura delle cellule
Citofluorimetro
Metodi di rottura delle cellule:
Omogenizzazione, French Press, sonicazione, metodi meccanici,metodi enzimatici e con l’uso di abrasivi. Importanza e contenuti dei principali tamponi di estrazione.
Tecniche di centrifugazione:
Principi di base della sedimentazione, tipi di rotori (angolo fisso , alloggiamento versticale, bracci oscillanti, elutriatori). Tipi di centruifughe. Tecniche di sedimentazione (differenziale, in gradiente di densita’, per elutriazione). Materiali per gradienti. Ultracentrifughe: generalita’ di utilizzo.
Purificazione e caratterizzazione delle proteine:
Proprieta’ ioniche degli aminoacidi e delle proteine native e in soluzione. Punto isoelettrico. Stabilita’ (termica e in presenza di pH variabile). Criteri di solubilita’ e loro utilizzo per la purificazione delle proteine (frazionamento con sali, solventi organici, PEG, precipitazione isoelettrica). Utilizzo della metodi di quantificazione delle proteine in soluzione: spettrofotometria ottica e all’ultravioletto per la determinazione della concentrazione di campioni proteici, colorazione di Bradford, Lowry.
Tecniche elettroforetiche e di trasferimento su carta, immunoblotting analysis:
Principi generali dell’elettroforesi su matrici solide. Elettroforesi su Gel di agarosio e poliacrilammide (PAGE). Matrici per elettroforesi e loro utilizzo. Elettroforesi su SDS-PAGE. Tipi di tamponi utilizzati per l’analisi PAGE : continui e discontinui. Isoelettrofocusing (IEF) e gel bidimensionali: criteri generali. Generalita’ sull’uso di gel bidimensionali e il loro utilizzo in proteomica e spettrometria di massa (MALDI-TOF).
Western blotting. Tipi di membrane utilizzate e criteri di utilizzo. Rivelazione delle proteine tramite colorazione su gel :Comassie brilliant Blue, Silver staining. Rivelazione delle proteine: tramite colorazione su membrana (Ponceau S) o con anticorpi coniugati ad enzimi o fluorocromi (immunodetection)
Tecniche cromatografiche:
Principi generali di cromatografia (Risoluzione, efficienza, capacità), cromatogramma. Cromatografia su colonna (setaccio molecolare, a scambio ionico, affinita’, idrofobicita’, HPLC, FPLC): generalità d’utilizzo.
Radio-isotopi:
Naturra della radioattivìtà: Tipi di radioattività. Decadimento. Unità di radioattività.
Sicurezza. Rivelamento e misura della radioattività: Tubi di Geiger-Muller. Contatori a scintillazione liquida.
Autoradiografia. Uso in biochimica dei radioisotopi. Traccianti.
Produzione di anticorpi:
Anticorpi policlonali. Anticorpi monoclonali. Tecniche di produzione degli anticorpi.

ESERCITAZIONI PRATICHE:
1) Frazionamento subcellulare: isolamento della frazione nucleare e mitocondriale da omogenato di tessuto muscolare bovino.
2) Determinazione quantitativa delle proteine totali: metodo del biureto.
3) Saggi di attività enzimatica: ; dosaggio dell’enzima lattico deidrogenasi in sovranatante di tessuto muscolare bovino.
4) Saggi di attività enzimatica: cinetica enzimatica dell’adenosina deaminasi determinazione dei parametri Km e Vmax;
5) Saggi di attività enzimatica: cinetica enzimatica dell’adenosina deaminasi determinazione della dipendenza dal pH.
6) Separazione elettroforetica di proteine su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti.

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Wilson K, Goulding K. METODOLOGIE BIOCHIMICHE Raffaello Cortina Editore.