Sono richieste conoscenze teoriche di biologia cellulare, di chimica e chimica organica, e di biochimica delle macromolecole.

Richiami sulla struttura delle cellule eucariotiche e procariotiche. Le colture di cellule eucariotiche, loro separazione, analisi e conteggio.

LE PROTEINE: 1) Estrazione delle proteine da tessuti animali e culture cellulari. Allestimento di omogenati d’organo, di lisati cellulari; frazionamento dei componenti subcellulari. 2) Determinazione quantitativa delle proteine totali: dosaggio dell’azoto proteico, metodi del biureto, di Folin-Ciocalteau, di Lowry; spettrofotometria diretta con applicazione delle formule di Kalckar-Warburg, turbidometria, nefelometria. 3) Determinazione qualitativa e quantitativa delle proteine mediante saggi di attività biologica: a) saggi di attività enzimatica «in vitro», criteri orientativi per la scelta delle condizioni di saggio (temperatura, pH, concentrazione dell’enzima e del substrato, cofattori, tempi di incubazione), calcolo delle unità e dell’attività specifica; b) determinazione immunologica delle proteine: generalità sugli anticorpi mono- e policlonali; saggi di immunodiffusione, saggi radioimmunologici (RIA), saggi immunoenzimatici (ELISA). 4) Tecniche radioisotopiche: rilevazione e misura della radioattività; utilizzo di molecole radiomarcate in biochimica; studio di proteine di legame mediante ligandi radiomarcati (studi di legame all’equilibrio e studi di competizione). 5) Metodi di purificazione delle proteine: precipitazione frazionata al calore, al punto isoelettrico, con solventi organici e sali neutri. Centrifugazione frazionata in mezzo omogeneo ed in gradienti di densità continui e discontinui. Tecniche cromatografiche (gel filtrazione, a scambio ionico, di affinità, cromatografia liquida ad alta pressione); tecniche elettroforetiche: elettroforesi su gel di poliacrilammide (in condizioni native e denaturanti), immunoelettroforesi, elettrofocusing, elettroforesi bidimensionale. Criteri di purezza delle preparazioni proteiche: cristallizzazione, ultracentrifugazione, disc-elettroforesi, curve di solubilità. Ingegnerizzazione di proteine per la purificazione. 6) Determinazione della struttura proteica: analisi di aminoacidi; determinazione della struttura primaria.

GLI ACIDI NUCLEICI 1) Composizione e struttura degli acidi nucleici: DNA e RNA. 2) Isolamento e separazione degli acidi nucleici: separazione dalle macromolecole proteiche mediante fenolizzazione, frazionamento degli acidi nucleici per centrifugazione in gradienti di densità autoformati, per cromatografia ed elettroforesi in gel di agarosio e poliacrilammide. 3) Il comportamento del DNA in soluzione, la denaturazione del DNA, la renaturazione, il punto di fusione. Determinazione spettrofotometrica quantitativa del DNA e RNA. 4) Manipolazione degli acidi nucleici: gli enzimi di restrizione.

TECNICHE AVANZATE: 1) Fluorimetria e spettrofluorimetria: applicazioni. 2) Chemiluminescenza e bioluminescenza: applicazioni. 3) Risonanza Magnetica Nucleare (NMR): applicazioni in biologia. 4) Spettrometria di massa: applicazione allo studio delle proteine. 5) Risonanza plasmonica di superficie (SPR): applicazione per lo studio dell’interazione delle biomolecole.

ESERCITAZIONI PRATICHE DI LABORATORIO: 1) Saggi di attività enzimatica: cinetica enzimatica dell’adenosina deaminasi; dipendenza della cinetica enzimatica dal pH; dosaggio dell’enzima lattico deidrogenasi. 2) Frazionamento subcellulare. 3) Determinazione quantitativa delle proteine totali: metodo del biureto e di Bradford. 4) Separazione elettroforetica di proteine su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti. Western-blot. 5) Separazione elettroforetica del RNA totale su gel di agaroso. 6) Immunodosaggio: ELISA di tipo competitivo od a sandwich.

Testi consigliati

• D.L. Nelson, M.M. Cox: PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER. Zanichelli 2010;
• C. De Marco, C. Cini: PRINCIPI DI METODOLOGIA BIOCHIMICA. Piccin 2009;
• M.C. Bonaccorsi Di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo: METODOLOGIE BIOCHIMICHE. Casa Editrice Ambrosiana 2012;
• A.J. Ninfa, D.P. Ballou: METODOLOGIE DI BASE PER LA BIOCHIMICA E LA BIOTECNOLOGIA. Zanichelli, 2000;
• B. Mondovì : BIOCHIMICA APPLICATA. Idelson 1977.

L'esame è composto da:

• Una prova in itinere al termine dell'attività di laboratorio che verterà su argomenti affrontati durante tale attività. Tale prova sarà scritta con tests a risposta mutipla e domande aperte.
• Una prova finale scritta sarà costituita da tre domande aperte su argomenti svolti durante il corso, una domanda a risposta multipla o similare su argomenti riguardanti le tecnologie avanzate, ed eventaulemte una domanda in cui si richiede di svolgere un calcolo che potrebbe essere necessario lavorando in un laboratorio di biochimica.