CourseMOLECULAR BIOTECHNOLOGY
Code479EE
Credits3
PeriodSemester 2
LanguageItalian
| Modules | Area | Type | Hours | Teacher(s) | |
| TECNICHE DI MICROSCOPIA E LIVE IMAGING APPLICATE AI MICRORGANISMI | BIO/19 | LEZIONI | 32 |
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Il corso fornisce conoscenze avanzate di microscopia, utili per affrontare lo studio dei microrganismi in ambito bio-medico, Biotecnologico, industriale ed agrario.
Verranno studiati i principi alla base della microscopia ottica, confocale ed elettronica utilizzata per la visualizzazione e lo studio dei microorganismi in stato planktonico, intracellulare ed associato ai biofilm. Successivamente, verranno presentate le tecniche per la colorazione e l’analisi dei microorganismi Infine, verranno studiate le tecniche di microoscopia ad alta risoluzione per analisi di processi microbiologici mediante live imaging.
Il corso si prefigge di fornire allo studente una conoscenza di base sulle principali tecniche di microscopia allo scopo di studiare non solo la fisiologia ed i meccanismi di virulenza dei microorganismi patogeni per l’uomo, gli animali e le piante, ma anche di apprendere praticamente (mediante le esperienze di laboratorio) come effettuare analisi di imaging su campioni microbici vivi e fissati
The course provides advanced knowledge in microscopy useful for dealing with the study of microorganisms in the bio-medical, biotechnological, industrial and agricultural fields.
The basic principles of optical, confocal and electronic microscopy recorded for the visualization and study of microorganisms in planktonic, intracellular and associated with biofilms will be studied. First, the basic techniques for the coloring and analysis of microorganisms will be presented. Finally, the techniques of microoscopy and high resolution for the analysis of microbiological processes through live imaging will be studied.
The course aims to provide the student with a basic knowledge of the main microscopy techniques in order to study not only the physiology and virulence mechanisms of pathogenic microorganisms for humans, animals and plants, but also to learn practically (through laboratory experiences) how to perform imaging analyzes on live and fixed microbial samples
Lo studente verrà valutato per la sua capacità di discutere con linguaggio scientifico appropriato i principali contenuti del corso. Inoltre, durante le esperienze di laboratorio sarà valutata anche l'attitudine nel mettere in pratica le procedure sperimentali spiegate dal docente.
Each student will be assessed for his ability to discuss the main contents of the course with appropriate scientific language. Furthermore, during the laboratory experiences the experimental attitude in putting into practice the experimental procedures explained by the teacher will also be evaluated.
Lo sudente al termine del corso sarà in grado di progettare esperimenti che prevedano l’impiego delle tecniche di microscopia di base e ad alta risoluzione per lo studio dei microrganismi. Inoltre, lo studente sarà in grado di tradurre in pratica ed eseguire gli approcci sperimentali illustrati durante le esperienze di laboratorio, sotto la supervisione dei docenti
At the end of the course, each student will be able to design experiments that involve the use of basic and high resolution microscopy techniques for the analysis of microorganisms. In addition, the student will be able to put into practice and perform the experimental approaches illustrated during the laboratory experiences, under the supervision of the teachers
Lo studente deve saper discutere criticamente delle esperienze di laboratorio svolte, spiegandone il razionale e l'approccio sperimentale
The student must be able to critically discuss the laboratory experiences carried out, explaining their rationale and experimental approach
Risultati attesi. Apprendimento, mediante esempi rappresentativi, delle principali applicazioni delle tecniche di micoscopia utili per la diagnostica microbica, lo studio della fisiologia dei microorganismi in contesti simili a quelli in vivo.
Expected results: Learning, through representative examples, of the main applications of mycoscopy techniques for analysis to microbial diagnostics, the typing of microorganisms, metagenomics, new strategies for prevention and treatment of infections.
Durante le sessioni di laboratorio saranno valutati il grado di accuratezza e precisione delle attività svolte.
During the laboratory sessions the degree of accuracy and precision of the activities carried out will be assessed.
Per una propria comprensione delle tematiche affrontate è richiesta la conoscenza della Microbiologia generale, Chimica, Fisica e Biologia molecolare
For a proper understanding of the topics addressed, knowledge of General Microbiology, Chemistry, Physics and Molecular Biology is required.
- Il corso prevede lezioni frontali con l'ausilio di slide, esercitazioni in aula ed un ciclo di esperienze di laboratorio.
- Il materiale didattico può essere interamente scaricato attraverso la piattaforma e-learning
- Interazioni tra studente e docente via mail e ricevimento.
- The course includes lectures with the help of slides, classroom exercises and a cycle of laboratory experiences.
- The teaching material can be entirely downloaded through the e-learning platform.
- Interactions between student and teacher via email and reception.
Lezioni frontali:
- Introduzione alla microscopia. Principi di ottica. Definizione di risoluzione e apertura numerica delle lenti. Caratteristiche della microscopia ottica e struttura del microscopio ottico.
- Microscopia ottica in campo chiaro, in campo oscuro e a contrasto di fase.
- Microscopia a Fluorescenza. Principi di fluorescenza e tipologia di fluorofori.
- Microscopia confocale a scansione. Applicazione della fluorescenza alla confocalità. Analisi al microscopio di un biofilm. Visualizzazione della componente cellulare e della matrice di un biofilm. Colorazione Dead/Live. Analisi 3D dei biofilm.
- Diagramma di Jablonski. Quenching e Photobleaching. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP). Fluorescence resonance energy transfer (FRET).
- Radiazione elettromagnetica. Eccitazione a due fotoni. Tempo di vita della fluorescenza e dell'autofluorescenza. Il phasor plot. Il "mapping". Tecnica FLIM (Fluorescence lifetime imaging microscopy). Analisi del Fingerprinting metabolico dei batteri mediante FLIM.
- Principi di microscopia elettronica. Microscopia elettronica a trasmissione e microscopia eletrronica a scansione.
Laboratorio:
- Fissazione dei campioni e colorazione di Gram. Analisi al microscopio di vetrini colorati mediante colorazione di Gram provenienti da campioni clinici.
- Tecniche di colorazione di bacilli alcol-acido resistenti. Colorazione di Kinyoun di Micobacterium smegmatis. Analisi del campione mediante microscopia ottica. Visualizzazione di diversi campioni clinici contenenti micobatteri.
- Microscopia ottica di campioni non fissati. Analisi a fresco di spore batteriche. Imaging della colonia di Bacillus cereus mediante microscopio ottico invertito. Analisi della motilità di Bacillus cereus. Conta di Candida albicans mediante analisi a fresco di una coltura su camera di Burke
- Colorazione Dead/live and Sypro Ruby di un biofilm batterico. Analisi mediante microscopia confocale a fluorescenza con LEICA Sp5.
- Acquisizione FLIM e analisi mediante phasor plot dell'autofluorescenza del NADH "free" e "bound" di Staphylococcus aureus vitale in varie condizioni fisiologiche (fase di crescita esponenziale, fase di crescita stazionaria ed associato ai biofilm) ed incubato in presenza di diverse classi di antibiotici e inibitori del metabolismo cellulare.
- Preparazione dei campioni ed acquisizione di immagini mediante la microscopia elettronica a trasmissione con relativa analisi.
Lessons:
- Introduction to microscopy. Principles of optics. Definition of resolution and numerical opening of lenses. Features of optical microscopy and optical microscope structure.
- Light-, dark, phase contrast optical microscopy.
- Fluorescence microscopy. Principles of fluorescence and type of fluorophores.
- Scanning confocal microscopy. Applying fluorescence. Microscope analysis of a biofilm. Display of the cell component and matrix of a biofilm. Dead/Live coloring. 3D analysis of biofilms.
- Jablonski diagram. Quenching and Photobleaching. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP). Fluorescence resonance energy transfer (FRET).
- Electromagnetic radiation. Excitement with two photons. Life time of fluorescence and self fluorescence. The fasori. The phasor plot. The "mapping" is the "mapping". Flim. metabolic fingerprinting of bacteria via Fluorescence lifetime imaging microscopy.
- Principles of electron microscopy. Transmission electron microscopy and scanning electron microscopy.
Laboratory:
- Sample fixation and Gram coloring. Microscope analysis of Gram coloured slides from clinical samples.
- Alcohol-acid staining techniques. Kinyoun coloring by Micobacterium smegmatis. Sample analysis using optical microscopy. Visualization of several clinical samples containing mycobacteria.
- Optical microscopy of unso fast samples. Fresh analysis of bacterial spores. Imaging of the Bacillus cereus colony using an inverted optical microscope. Analysis of the motility of Bacillus cereus. Candida albicans counts by fresh analysis of a Burke chamber crop
- Dead/live and Sypro Ruby coloring of a bacterial biofilm. Fluorescence confocal microscopy analysis with LEICA Sp5.
- FLIM acquisition and analysis by phasor plot of the autofluorescence of the NADH "free" and "bound" of Staphylococcus aureus vital under various physiological conditions (exponential growth phase, stationary growth phase and associated with biofilms) and incubated in the presence of different classes of antibiotics.
- Preparation of samples and imaging using transmission electron microscopy with image analysis.
Articoli scientifici e Presentazioni Power Point delle lezioni, resi disponibili su Moodle
Scientific articles and Power Point Presentations of all lessons are available on Moodle.
Stesso programma utilizzato per verificare la preparazione degli studenti non frequentanti. Il materiale didattico relativo al corso può essere reperito su moodle. Per la certificazione dei crediti di laboratorio e sostenere l'esame è fondamentale aver seguito almeno il 75% delle ore di laboratorio.
Same program used to verify the preparation of non-attending students. The didactic material related to the course can be found on moodle
Esame orale, volto ad attestare le capacità dello studente ad avere assimilato i contenuti del corso, esprimendosi con un linguaggio scientifico adeguato. Nel corso dell'esame orale, verrà verificata anche la comprensione delle esperienze di laboratorio effettuate durante l'anno.
Oral exam, aimed at certifying the student's ability to have learnt all the topics of the course. Ability to communicate with an appropriate scientific language. During the oral exam, the understanding of laboratory experiences carried out during the course will also be verified.
Commissione:
Presidente: Dr Di Luca Mariagrazia
Membro: Dr Poma Sajama Noemi Violeta
Presidente supplente: Prof Tavanti Arianna