CourseMOLECULAR BIOTECHNOLOGY
Code555EE
Credits3
PeriodSemester 2
LanguageItalian
| Modules | Area | Type | Hours | Teacher(s) | |
| MICROSCOPIA DI FLUORESCENZA PER L'ANALISI DI SISTEMI BIOLOGICI ALLA NANOSCALA | BIO/10 | LEZIONI | 32 |
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Il corso ha come obiettivo quello di fornire principi ed esperienze pratiche sulle principali tecniche di microscopia di fluorescenza per l’analisi di processi biologici che avvengono alla scala nanometrica. Particolare enfasi sarà rivolta all’utilizzo della microscopia a super-risoluzione per lo studio di complessi molecolari (es: protein binding), delle fasi nanocondensate (es: topological associating domains sulla cromatina, lipid rafts in membrana) e dei processi di internalizzazione cellulare di sistemi esogeni (es: virus). Parte delle conoscenze (16h) saranno acquisite mediante lezioni di tipo frontale. Tali conoscenze saranno poi integrate da conoscenze ottenute in attività di laboratorio (16h), siano esse di tipo diretto (acquisizioni di immagini al microscopio) o di analisi dati.
The course is aimed at providing basic concepts and practical aspects on main techniques of fluorescence microscopy to investigate nanoscale biological systems. Particular emphasis will be given to the application of super-resolution microscopy to study molecular complexes (e.g. protein binding), nanocondensates (e.g. topological associating domains on chromatin, membrane lipid rafts), and the internalization processes of external bodies (e.g. viruses). Part of the knowledge (16h) will be acquired through lectures. This knowledge will then be integrated by knowledge obtained in laboratory activities (16h), whether direct (acquisition of images under the microscope) or data analysis.
La verifica delle conoscenze avverrà nella forma dell’esame orale, oltre che attraverso gli incontri docente-studenti e il ricevimento.
The verification of knowledge will take place in the form of an oral exam, as well as through teacher-student meetings and reception.
Al termine del corso lo studente avrà acquisito conoscenze, teoriche e pratiche, per condurre esperimenti di imaging ottico su campioni biologici (cellule, tessuti) con risoluzione nanometrica. Tali conoscenze risultano rilevanti per capire e razionalizzare il meccanismo di svariati processi biologici cellulari e si integrano con analisi “omics”.
At the end of the course the student will have acquired theoretical and practical knowledge to conduct optical imaging experiments on biological samples (cells, tissues) with nanometric resolution. This knowledge is relevant for understanding and rationalizing the mechanism of various cellular biological processes and is integrated with "omics" analyses.
Saranno proposti piccoli test informali, in particolare nell’ambito dell’analisi dati, per verificare l’acquisizione di conoscenze su particolari temi.
Small informal tests will be proposed, particularly in the field of data analysis, to verify the acquisition of knowledge on particular topics.
Sarà acquisita sensibilità nell’ambito della raccolta e analisi di dati sperimentali relativamente a processi intracellulari ottenuti mediante imaging ottico ad alta/super-risoluzione.
Sensitivity will be gained in the collection and analysis of experimental data relating to intracellular processes obtained by high/super-resolution optical imaging.
Saranno proposti piccoli test informali, in particolare nell’ambito dell’analisi dati, per verificare l’acquisizione di sensibilità su particolari temi (e.s.: imaging su cellule in condizioni vitali).
Small informal tests will be proposed, particularly in the context of data analysis, to verify the acquisition of sensitivity on particular topics (e.g.: imaging on living cells).
Non è richiesto nessun specifico prerequisito, se non curiosità riguardo alla comprensione analitica dei meccanismi cellulari e sensibilità verso i metodi quantitativi di ricerca. Durante il corso verrà presentata una breve descrizione dei concetti fondamentali dell'ottica geometrica per colmare eventuali lacune.
No specific prerequisites are required, except curiosity about the analytical understanding of cellular mechanisms and sensitivity towards quantitative research methods. During the course a brief description of the fundamental concepts of geometric optics will be presented to fill any background gaps.
Le lezioni saranno svolte in modalità frontale con l'ausilio di slides e filmati.
Il materiale didattico (slides, eventuali articoli) sarà reso disponibile sul sito di elearning e su eventuali altri siti web.
Il docente è disponibile per il ricevimento secondo le modalità riportate sul sito unimap.
Non sono previste prove in itinere.
The lessons will be carried out in frontal mode with the help of slides and movies.
The teaching material (slides, any articles) will be made available on the elearning site and on any other websites.
The teacher is available for reception according to the procedures indicated on the unimap website.
There will be no ongoing tests.
Di seguito sono riportati i principali argomenti trattati nel programma. Si noti che per ogni tecnica descritta saranno riportati esempi di imaging cellulare relativi alle applicazioni della super-risoluzione allo studio di processi biologici. Tali esempi sono tratti anche dall’esperienza diretta del docente nell’ambito del suo campo di ricerca.
LEZIONI FRONTALI
A – Basi di microscopia ottica (~2 ore)
- Cenni di ottica geometrica
- Come è fatto un microscopio?
- Il primo parametro rilevante: il contrasto
- Microscopia a campo chiaro e a contrasto di fase
B – La microscopia di fluorescenza limitata dalla diffrazione (~4 ore)
- Cosa è la fluorescenza?
- Il microscopio a fluorescenza wide field
- Il secondo parametro rilevante: la risoluzione spaziale e la teoria di Abbe
- Risoluzione, sezionamento e contrasto: il microscopio confocale
- Microscopia su campioni fissati e su campioni vitali: immunofluorescenza sonde geneticamente codificate
C – La microscopia di fluorescenza a super risoluzione (~8 ore)
- Teoria della super-risoluzione
- Forster Resonance Energy Transfer: il primo esempio di super-risoluzione
- Image Scanning Microscopy
- Microscopia STED e RESOLFT
- Single Molecule Localization Microscopy: STORM e F-PALM
- Super-resolution Optical Fluctuation Imaging (SOFI)
- Structured Illumination Microscopy (SIM)
D – Dinamica della diffusione di singole molecole (~2 ore)
- Spettroscopia di correlazione
- Single particle tracking
LABORATORIO
A – Esperimenti di super-risoluzione mediante Imaging Scanning Microscopy (~8 ore)
- Gli studenti parteciperanno, a gruppi, a esperimenti di imaging su cellule e tessuti mediante microscopia ISM Airyscan. Se possibile sarà prevista una parte di laboratorio relativa alla preparazione del campione
B – Analisi di immagini da super-risoluzione (~8 ore)
- Cluster analysis
- Colocalizzazione
- Analisi di processi diffusivi
- Deconvoluzione
The main topics covered in the program are listed by following. Examples of cellular imaging related to the applications of super-resolution to the study of biological processes will be reported for each technique. These examples are also taken from the teacher's direct experience in his research field.
FRONTAL LESSONS
A – Basics of optical microscopy (~2 hours)
- Fundamentals of geometric optics
- How is a microscope made?
- The first relevant parameter: contrast
- Brightfield and phase contrast microscopy
B – Diffraction-limited fluorescence microscopy (~4 hours)
- What is fluorescence?
- The wide field fluorescence microscope
- The second relevant parameter: spatial resolution and Abbe's theory
- Resolution, sectioning and contrast: the confocal microscope
- Microscopy on fixed and viable samples: immunofluorescence vs. genetically encoded probes
C – Super resolution fluorescence microscopy (~8 hours)
- Super-resolution theory
- Forster Resonance Energy Transfer: the first example of super-resolution
- Image Scanning Microscopy
- STED and RESOLFT microscopy
- Single Molecule Localization Microscopy: STORM and F-PALM
- Super-resolution Optical Fluctuation Imaging (SOFI)
- Structured Illumination Microscopy (SIM)
D – Diffusion dynamics of single molecules (~2 hours)
- Correlation spectroscopy
- Single particle tracking
LABORATORY
A – Super-resolution experiments using Imaging Scanning Microscopy (~8 hours)
- Students will participate, in groups, in cell and tissue imaging experiments using Airyscan ISM microscopy. If possible, a laboratory part relating to the preparation of the sample will be foreseen
B – Analysis of super-resolution images (~8 hours)
- Cluster analysis
- Colocalization
- Analysis of diffusion processes
- Deconvolution
Oltre alle slides del corso (che saranno messe a disposizione di tutti gli studenti al termine di ogni lezione), alcuni argomenti sono trattati dai seguenti libri:
- Ann Wheeler and Ricardo Henriques "Standard and Super‐Resolution Bioimaging Data Analysis: A Primer", John Wiley & Sons, Hoboken (NJ), 2018
- Barry R. Masters "Superresolution Optical Microscopy", Springer Series in Optical Sciences, Springer Nature Switzerland2020
Beside the slides of the course (that will be made available to all students following each lesson), some topics are covered by the following books:
- Ann Wheeler and Ricardo Henriques "Standard and Super‐Resolution Bioimaging Data Analysis: A Primer", John Wiley & Sons, Hoboken (NJ), 2018
- Barry R. Masters "Superresolution Optical Microscopy", Springer Series in Optical Sciences, Springer Nature Switzerland2020
N.A.
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La prova orale consiste in un colloquio tra il candidato e il docente. Il colloquio inizia con la la descrizione di un articolo che descrive -in maniera generale- un tema di imaging ottico su scala nanometrica applicato a processi cellulare (es: imaging dei processi di binding tramite FRET). L’articolo viene preventivamente scelto dallo studente in un gruppo pre-selezionato dal docente o proposto dallo studente stesso e approvato dal docente. A partire dall’articolo, la prova si allarga a temi collegati presentati all’interno del corso. La durata del colloquio è di circa 30-40 minuti.
The oral test consists of an interview between the candidate and the teacher. The interview begins with the description of an article that describes - in a general way - a topic of optical imaging on the nanometric scale applied to cellular processes (eg: imaging of binding processes via FRET).The article is previously chosen by the student in a group pre-selected by the teacher or proposed by the student himself and approved by the teacher. Starting from the article, the test expands to connected themes presented within the course. The duration of the interview is approximately 30-40 minutes.
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